遠緣雜交在水稻遺傳育種中的應用

張國棟 鄒丹丹單貞 邵曉宇 張夢旭郭海鵬 米鐵柱,2李繼明*

（1青島海水稻研究發展中心，山東青島266000；2中國海洋大學/海洋環境與生態教育部重點實驗室，山東青島266100；第一作者：zhangguodong＠searice.org；*通訊作者：lijiming＠searice.org）

水稻（Oryza sativaL.），作為全球近 50%人口的主要糧食作物，具有產量高、種植區域廣泛、種質資源豐富等優點。近年來，隨著雜交水稻的長期推廣與大面積種植，各品種間遺傳背景差異減小，增產放緩，對病蟲害及不良環境的抵抗力下降，不利于糧食戰略的可持續發展。早在1987年，袁隆平院士就提出水稻發展戰略的三個階段，依次是品種間、亞種間和遠緣雜種優勢的利用[1]。目前，我國的水稻產業主要以三系和兩系為主，稻米產量一直處于穩產、高產水平，水稻品種間和亞種間雜種優勢的利用為解決世界糧食危機做出了巨大的貢獻[2]。“野敗”（wild abortive，WA）雄性不育株的發現，使三系法雜交水稻育種取得成功，而光溫敏核不育水稻的發現使兩系法利用雜種優勢成為可能，每一次具有重要價值的新種質材料的利用，都是水稻遺傳育種取得突破性進展的重要前提。由于野生稻和其他種屬的物種與栽培稻之間的巨大差異，遠緣雜種優勢的利用將成為解決栽培稻遺傳基礎狹窄、擴大遺傳變異及創造新種質資源的有效途徑。

雖然水稻遠緣雜交具有廣闊的利用前景，但由于種間遺傳距離較遠，種屬間雜交配合力很弱，遠緣雜交后代性狀表現出雜交不親和或雜交結實率很低、雜種不育或育性差、雜種后代性狀分離雜亂及分離世代長等現象[3]。但物種間遠緣雜交可實現種屬間優良基因的重組交流，從而培育出具有新性狀的優質植物新類型甚至新物種，如竹稻等，具有分蘗旺盛、莖稈粗壯、稻米品質與抗性增強等特點[4]。另外，水稻遠緣雜種優勢的利用主要有物種間直接的有性雜交（sexual hybridization）、體細胞雜交（somatic cell hybridization）、外源DNA 導入（exogenous DNA introduction）、基因工程等[5]，且基于胚拯救[6]、水稻不育基因[7]、InDel 分子標記[8]、染色體片段代換體系[9]等理論方法的研究，為水稻遠緣雜交育種創造了條件。本文概述了遠緣雜交所涉及的分子機理及水稻遠緣雜交育種思路，詳述了水稻種屬間雜交現狀、現存障礙及解決措施，為加快遠緣物種基因資源在水稻育種上的應用提供參考。

1 水稻遠緣雜交概述及理論假說

在水稻育種中，通過不同的水稻遠緣雜種優勢利用途徑（有性雜交、外源DNA直接導入技術、多倍體雜交等），對水稻遠緣雜交真實性進行鑒定（形態學標記、分子標記、染色體分帶、流式細胞室等技術等[10]），可以提高水稻品種（組合）的抗病性、抗逆性、適應性、產量，改良品質性狀，創造新種質，達到引入外源優良基因改良已有水稻品種的目的。目前，水稻遠緣雜交的類型分為精卵結合型（C型）和非精卵結合型（N型）[11]。水稻有性雜交，即精卵結合型遠緣雜交，一般發生在染色體組相同的種內、亞種間或染色體組一致性較高的種間，其雜種細胞中含有母本的整套染色體和父本的整套或部分染色體，雜種所表現的性狀包括兩親的性狀或中間類型。而N型則發生在親緣關系較遠的種間或屬間，由于基因組大小、結構等差異巨大，導致DNA分子出現差異性排斥現象，使雜種在染色體數目和組型上與母本并無太大區別，雜種性狀易產生明顯的變異，但雜交成功率變低。盡管水稻遠緣雜交具有困難和復雜性，但目前，水稻品種內雜交難以完全滿足育種目標的要求，遠緣雜交育種在國內外歷來都倍受重視。我國育種工作者在水稻遠緣雜交分子機理方面也做了大量研究工作，已形成了幾種理論體系。

（1）DNA片段雜交假說。1978年，周光宇提出了DNA片段雜交假說，認為供體DNA會被受體酶解成若干片段，而少量片段可能僥幸整合進受體的基因組，從而影響子代基因表達[12]。（2）雙重作用假說。1992年，萬文舉等認為，外源DNA的導入具有基因轉移和誘變雙重作用，從而提出了雙重作用假說，外源DNA片段插入受體基因組，不僅會導入遠緣基因，還有可能引起受體基因組的基因突變[13]。（3）外源基因滲透學說。1999年劉寶等依據水稻和菰（Zizania latifolia）的遠緣雜交研究結果，提出了外源基因滲透學說，認為外源基因的進入引起受體基因組的沖擊，受體基因組會趨向于通過刪除一些特異性序列來維持自身基因組穩定，或通過甲基化等途徑來調控基因表達。而由外源基因組的沖擊導致的基因組不穩定，可能會帶來部分同源區段的基因重組，同時，受體基因組結構的改變，極易引起基因突變、轉座子激活等現象，以及甲基化所引起的基因沉默或激活等表達水平的變化，這些遺傳與表觀遺傳變化在一定程度上導致遠緣雜種后代瘋狂分離，很難在短時間內穩定、純合，而由于基因表達與調控紊亂所引起的花粉或胚囊發育受阻，導致雌雄配子普遍敗育[14-15]。

我國水稻育種歷經矮稈基因（第一次綠色革命）、不育系（核質互作不育系、光溫敏核不育系）、綠色超級稻（聚合抗逆、營養高效利用和理想株型基因）3次大的變遷[16]。其中秈粳亞種間雜種優勢的利用為水稻遺傳育種革命變遷提供了基礎[17]，未來如何將遠緣物種有利基因應用于綠色超級稻是一個重要的研究方向。

2 水稻遠緣資源的利用

2.1 水稻種間遠緣資源的利用

學術界對稻屬中種的數量及分類一直持有不同的觀點。目前比較公認的稻屬分類含有23個種，其中含2個栽培種和21個野生種，分別歸屬于AA、BB、CC、BBCC、HHJJ等10個染色體組，其中最大類群AA基因組包含亞洲栽培稻、非洲栽培稻2個栽培種和其他6個野生稻種[18]。栽培稻與野生稻的遠緣雜交研究始于20世紀初，利用普通野生稻和栽培稻的天然雜交后代，丁穎先生育成了優良品種中山1號，隨后衍生出中山紅、包胎矮等許多品種，這些水稻品種的選育均利用了中山1號部分野生稻的優質基因性狀，為栽培稻種植與改良作出了重要貢獻[19]。隨后，國內外學者還利用了三系法（秈/粳型細胞質雄性不育系育成的高異交率偏秈/粳型廣親和不育系與中間型恢復系配組、偏秈/粳型不育系與廣親和恢復系配組）和兩系法（廣親和光溫敏不育系與偏秈/粳型恢復系配組）在水稻種間抗病、改良栽培稻株型、高產等方面展開研究[20]。

在野生稻種質資源的利用過程中，通過種間雜交與長期選育，國際水稻研究所已成功將來自于尼瓦拉野生稻的抗草狀矮縮病（rice dwarf virus，RDV）的基因和來自于長雄蕊野生稻的抗白葉枯病（bacterial leaf spot）顯性基因Xa-21轉移到栽培稻品種中[21]。除了引進抗病基因外，研究者也將目光放在改良栽培稻株型、改良稻米品質和提高水稻產量的研究方向上。通過普通野生稻與栽培稻的復合雜交，成功選育出耐肥、抗倒、高產、優質、抗病等諸多優良性狀的材料—西鄉糯[22]。在水稻亞種雜交生產方面，應用較廣的有配組育成的春優59[23]、甬優6號[24]、廣親和性光溫敏不育系培矮64S[25]及偏粳型廣親和不育系春江16A[26]等，為實現秈粳雜交水稻增產提供了材料。但秈粳雜種結實易受環境影響，結實率低、籽粒充實度偏差等制約了秈粳亞種間雜種優勢的利用。

隨著水稻基因組測序的完成，國內外掀起了水稻基因功能研究的熱潮，一些和遠緣雜交相關的功能基因，如袁隆平培育的Y兩優900創造了較大面積水稻單產新記錄，可能與母本培矮Y58S攜帶的廣親和基因有關[27]；萬建民團隊發現的不育“自私基因”ORF1、ORF2和ORF3，有望解決秈粳亞種間雜交稻結實率低的難題[28]。另外，通過克隆柱頭外露率、早花、廣親和基因等，為基因編輯技術實現種間雜種優勢的有效利用，種間雜交稻品種的培育提供了基礎。

2.2 屬間遠緣資源的利用

水稻屬間遠緣資源的利用比稻屬內野生資源的利用難度更大，由于遺傳距離更遠，植株形態、花粉結構、染色體數目和基因排列等差別更大，屬間遠緣雜交表現雜交不親和，雜種不育、結實率低等現象更加嚴重，配合力極差。但只要找到合適的物種，依然可以利用染色體的局部同源性及有性雜交手段，引入少量遠緣物種的遺傳物質。而且，由于遺傳距離遠，屬間遠緣雜交有可能大幅度改變栽培稻遺傳性狀，甚至得到新物種。

表1 水稻屬間遠緣雜交研究現狀

水稻屬間遠緣雜交中，高粱基因引入的報道較為深入。伏軍利用早稻品種87-156與青殼洋高粱雜交，選育出了具有穗大粒多、結實好、光合速率高、生長量大等優良性狀的超豐早1號，進一步研究顯示，青殼洋高粱的基因以隨體的形式拼接到了栽培稻的染色體上，形成了穩定的遺傳材料[29]。吉林通化農科院于1972年開始從事水稻和菰遠緣雜交的研究，獲得了一批性狀優良的菰稻資源，并于2011年通過了通育335的品種審定[30]。在水稻屬間的遠緣雜交中，經過多年研究，我國先后獲得了水稻與高粱、玉米、菰、竹子、假稻、蘆葦、月見草、稗草等十幾個科屬間遠緣雜交的雜種后代（表1），一方面利用這些植物的抗寒、抗旱、抗鹽、抗病蟲害等優質抗逆性狀，另一方面可以利用如玉米、高粱、稗草等C4植物根系發達、生長繁茂、喜溫耐旱、耐鹽堿、光合速率高等突出特點，培育高光效栽培稻新品種[31-46]。

屬間遠緣有利基因在栽培稻遺傳育種，特別是在抗性育種及超高產育種上，具有巨大的應用價值和潛力，但雜交不親和、分離世代長等依然是屬間遠緣雜交所面臨的問題。通過研究手段的不斷更新換代，如利用胚拯救、細胞融合、花粉管通道、穗莖基因注射等方法，可以短期內得到更多雜交材料，尤其是為后期的篩選提供足量的F1代材料，是創新水稻種質資源、培育抗逆性強、高質、優產水稻的重要途徑之一[47]。

3 水稻遠緣雜交障礙及其克服途徑

3.1 水稻遠緣雜交障礙的遺傳機制

許多育種實踐表明，由于親緣關系較遠物種間存在嚴重的生殖障礙而導致雜交往往難以成功。依據隔離時期不同將生殖隔離分為受精前隔離（生理隔離、親本不育及受精失敗等）和受精后隔離（雜種敗育、不育、失活等）。依據基因組水平不同將生殖隔離分為外在的隔離（依賴于基因型和環境互作的隔離機制，多由生態及地理隔離造成的）和內在的隔離（由遺傳不協調的基因組沖突引起的，包括成種基因不同、染色體結構變異、不同位點基因互作不親和、偏分離、核質互作等）[48]。導致水稻遠緣雜交失敗的關鍵原因是受精后/內在的障礙[49]。

雜種不育是水稻遠緣雜交受精后障礙最重要的形式[50]。OKA等[51]認為，復隱性基因配子體致死模式和單位點孢子體—配子體互作模式是栽培稻雜種不育基因作用的主要模式，可見不育基因，即成種基因是阻礙物種間基因交流的基因。YANG等[52]從水稻中克隆出一個不育基因S5，S5位點通過編碼3個緊密連鎖基因（ORF3-ORF5）損害胚囊的可育性，造成秈粳雜種間孢子發育異常。染色體結構變異也會引起雜種不育，褚啟人研究了146個不同生態型雜交組合F1及親本減數分裂的染色體行為，結果表明，染色體行為異常在F1植株和親本中都可能發生[53]。雜種敗育及失活可能由于雜種胚和胚乳組織在發育時缺乏協調性，或者當胚乳降解不能給胚提供生長所需的營養物質時，胚由于缺乏營養而停止發育并降解。

目前，對雜種不育遺傳機理的解釋有細胞質效應、染色體結構差異和基因控制理論（重復隱性配子致死、單座位孢子體-配子體互作、單座位孢子體不育和互補孢子體不育）。近年來隨著蛋白質組學的日益發展，越來越多的蛋白質被發現與胚胎敗育有密切關系[54]。

3.2 水稻遠緣雜交障礙的克服途徑

水稻遠緣雜交障礙的克服途徑可以從生殖隔離的遺傳機制中尋找。花粉不育或無法完成受精的克服途徑包括選取適宜親本、母本（選取重瓣性低、雌蕊正常、結實率高等優異性狀的材料）、多次重復授粉、蒙導花粉授粉、延遲授粉、切割柱頭法進行授粉、施加激素等方法處理。雜種不育、衰敗等可采取胚拯救（幼胚培養、胚珠培養、子房培養等）、體外受精、體細胞融合、染色體技術（染色體組合成、多倍體技術等）及染色體片段代換系（將遠緣物種中的基因向另外一個物種中漸滲的過程）等措施進行處理[55-56]。尤其是多倍體技術、染色體片段代換（CSSL）等對克服水稻遠緣雜交障礙取得了一定成果。

多倍體技術在小麥、西瓜、柑橘等物種上都已得到成功的應用，如異源八倍體小黑麥的選育，而在水稻多倍體遠緣雜交中，最初則是在秈粳亞種間雜種優勢的利用上。研究表明，水稻多倍體化后，其遺傳保守性減弱，遺傳可塑性增強[57]。通過四倍體水稻轉移優良基因，可更加廣泛地擴大雜交范圍，利用遠緣雜交產生更強的雜種優勢，甚至通過異源多倍體途徑創造新物種。黃群策等利用多種四倍體水稻與屬間植物假稻、狼尾草雜交，均獲得了飽滿的實粒種子，而以二倍體雜交時則很難獲得實粒種子[58-59]。通過四倍體水稻的橋梁作用，轉移遠緣物種的優良基因，擴大栽培稻基因池。雖然高結實率同源四倍體水稻材料已經通過一些誘變技術獲得，但其綜合性狀如產量、抗性等與常見栽培稻相比并沒有表現出優勢，且如何將其轉化為產量優勢，如何通過遠緣雜交進一步聚合有利基因，并維持其高結實及多倍體所特有的大粒等優勢性狀，尚不明確。

染色體片段代換是通過回交和分子輔助選擇構建的一套近等基因系，在QTL精細定位等具有積極意義。宋健東等[60]以粳稻日本晴為親本，廣西普通野生稻DP15為供體，在BC3F1代獲得79個代換片段，基本可以相互重疊并覆蓋水稻12條染色體，構建染色體片段代換體系有助于解析其遺傳基礎，也有利于在育種中利用這些優良性狀的基因位點。

體細胞雜交技術作為一種相對成熟的技術，已經在多種植物細胞融合中得到應用，并且獲得了再生植株，但在水稻與野生資源間的基因轉移上，還存在植株再生率低等現象，而再生植株細胞染色體丟失也是一種普遍現象[61]。如果將水稻多倍體育種技術與細胞融合技術相結合，在遠緣基因的利用上或許能開辟出一條新途徑，即在水稻多倍體育種普遍作為一種目的的背景下，將多倍體途徑作為一種中間育種手段，結合細胞融合技術、基因編輯技術等[62-63]。利用植株在生長發育過程中的自我篩選過程來培育新的材料，或許能為水稻育種提供一種新的思路。

4 展望

遠緣雜交是克服物種間存在的生殖隔離的重要手段之一，它將2個長期進化的穩定的遠緣物種中的有益基因重新組合，跨越有性雜交不親和的障礙，有可能組合出具有品質好、抗性強、產量高的新材料或新種質。在遠緣有性雜交方面存在雜種胚敗育、不育、結實率低等諸多問題。研究發現，遠緣雜交前用適宜的激素處理，能有效提高雜交種子獲得率，同時利用胚挽救等組織培養手段擴大雜種F1代種子出苗率[64]。目前，由于基因互作和表達調控的分子機制的復雜性，人們對于遠緣雜交過程中基因組變化及調控機制的認識還非常有限，通過遠緣有性雜交篩選有利種質資源還是一個相對隨機的過程。

另外，遠緣雜交在具有應用價值的新種質資源的選育上是一種重要的技術手段，在作物新品種的培育上歷來受到重視。水稻含2個栽培種和21個野生種，種質資源豐富，而禾本科屬間遠緣物種資源也極為豐富，具有抗病、耐鹽、高光效等多種有利性狀，為栽培稻遺傳改良和育種提供了極為寶貴的種質資源庫，但在資源利用上還亟待開發新的育種模式和策略。隨著水稻功能基因和調控機理研究的深入，野生稻遺傳圖譜的全面構建與研究，水稻遠緣雜交機理的研究解析和新的技術手段的出現，遠緣基因資源在水稻遺傳改良上的應用必然會更加全面深入，為水稻抗逆性增強、稻米品質提高和超高產育種展現更美好的前景。