試析茶乙香酰胺對人肝癌細胞生長的影響

夏雪倩

（華僑大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建泉州362021）

0 引言

結(jié)合相關(guān)惡性腫瘤而言，肝癌在預(yù)后方面相對較差。近年來，無論是發(fā)病率，還是病死率均呈現(xiàn)出明顯升高趨勢[1]。目前，針對肝癌發(fā)病機制，在相關(guān)臨床研究中并沒有得到確切結(jié)果，因此，結(jié)合肝癌治療，主要以多學(xué)科綜合治療為主。肝癌在特點方面，主要包括發(fā)病隱匿、發(fā)展迅速等，還包括惡性度高，具有較強的轉(zhuǎn)移、侵襲能力，對人體危害十分嚴重[2]。基于肝癌治療，臨床中涉及方法眾多，在患者分期不同的情況下，手術(shù)方式也呈現(xiàn)出明顯的不同。總體而言，在臨床中，多學(xué)科聯(lián)合治療個體化治療措施應(yīng)用已經(jīng)實現(xiàn)了全面推廣，有效促進了肝癌患者的五年生存率。但是，針對肝癌患者而言，疾病的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移仍是醫(yī)學(xué)界的一大難題。因此，相關(guān)工作人員應(yīng)建立在肝臟腫瘤生長抑制作為出發(fā)點，完成對相關(guān)新型抗腫瘤藥物、治療方案的研究，提高治療的高效性、低毒性，這也是臨床亟需解決的重要問題。

在我國茶葉作為一種飲品，具有較高的受眾度。茶氨酸屬于氨基酸成分，在茶葉中的存在具有普遍性。針對茶氨酸，其口味相對較為鮮甜，在作為食品添加劑使用的同時，其所具有的生理作用也是人們關(guān)注的重點。近年來，以茶氨酸合成技術(shù)逐漸成熟化作為背景，對其藥理作用的研究也不斷深入。相關(guān)研究表明，茶葉不僅具有降血脂、降壓作用，還具有抗輻射、腫瘤等作用，可有效實現(xiàn)對患者血管的保護，促進其機體免疫力提升[3]。同時，茶葉能夠在腫瘤細胞生長中起到一定的抑制作用，使化療藥物在應(yīng)用過程中，存在的毒副作用得以降低。受到結(jié)構(gòu)、生理特點的影響，茶氨酸在抗腫瘤方面相對較弱。因此，為實現(xiàn)對有效抑制肝癌細胞生長，本文以茶氨酸衍生物TEC作為研究對象，對其抑制作用予以觀察。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器

本文研究涉及HepG2細胞系、SMMC7721細胞系，其均來源于中國科學(xué)院上海研究所。針對DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、鏈霉素、青霉素，其主要來源于美國Hyclone 公司。其中，鏈霉素、青霉素劑量分別為100μg/mL、100U/mL，在Amersco 公司完成對胰蛋白酶的采購。臺盼藍0.4%，MTT 在Sigma 公司中予以采購。借助有效化學(xué)合成方法，完成對TEC的制備。

1.2 儀器

本文涉及儀器使用主要包括：（1）3111 型二氧化碳培養(yǎng)箱，來源于Thermo 公司。（2）TE2000-U 型倒置熒光顯微鏡，來源于Nikon 公司。（3）離心機，來源于Eppendorf 公司。（4）全自動酶標儀，來源于BIO-RAD公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

針對HepG2 細胞、SMMC7721 細胞，完成細胞復(fù)蘇。選擇DMEM 高糖培養(yǎng)液，其中，培養(yǎng)液主要成分為胎牛血清，10%、青鏈霉素，1%，將細胞置于其中，在培養(yǎng)箱（5%CO2）中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱應(yīng)控制在37℃。完成對細胞的觀察，在全皿范圍內(nèi)，細胞覆蓋程度達到70～80%，在確保其處于正常狀態(tài)良好的情況下，可進一步予以傳代處理。

1.4 MTT檢測法

本文主要涉及MTT 比色法的應(yīng)用，其可有效實現(xiàn)對細胞存活、生長的檢測。針對其檢測原理，基于活細胞線粒體，借助外源性MTT 還原性，可使琥珀酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為藍紫色結(jié)晶甲臜，其具有不溶于水的特性，主要在細胞中進行沉積。其中，針對甲臜，可應(yīng)用二甲基亞砜予以溶解，使用酶標儀，通過合理波長的選擇，完成光吸收值的測定，并以間接形式對活細胞數(shù)量予以反映。建立在一定的細胞數(shù)量基礎(chǔ)上，MTT 結(jié)晶量與其呈現(xiàn)為正比例，該方法在臨床中已經(jīng)逐漸普遍化。

具體操作：借助胰蛋白酶（0.25%），完成對數(shù)期肝癌細胞的處理，對細胞進行濃度調(diào)整，可控制在2*104/mL，在96孔板中，予以接種，以三個復(fù)孔完成組別的劃分，在二氧化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時間為24 小時，在培養(yǎng)完成后，將其與溶媒進行對照，并將TEC 加入其中，具體體積濃度包括16、64、125、250μM。應(yīng)用培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間在48 小時、72小時，培養(yǎng)完成后進行取出，結(jié)合每個孔位，將MTT 溶液加入其中，具體劑量為10μL，5mg/mL，將溫度控制在37℃，完成4 小時孵育，將上清液予以吸去。在各孔位中，進行DMSO 溶解甲臜添加，劑量為150μL，在搖床予以振搖，振搖溫度為25℃，時間為15min。借助酶標儀，結(jié)合實驗情況，予以適宜波長的選擇，以630nm作為參考波長，進行校準，最終確定波長為570nm，對各孔吸光度進行測定，完成相應(yīng)記錄后，對細胞相對生長率予以計算。將溶媒作為對照組，設(shè)定其為100%，對相關(guān)實驗組相對生長率加以計算，針對其在肝癌細胞生長中產(chǎn)生的影響進行分析，完成結(jié)果評價。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以（%）表示。計量資料采用t檢驗，以（均數(shù)±標準差）表示。P＜0.05 視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

本實驗主要使用方法為MTT 法。建立在不同濃度基礎(chǔ)上，圖2 為TEC 在SMMC7721 細胞中的影響，圖3 為TEC 在HepG2細胞中的影響。

研究結(jié)果表明，在藥物濃度增加的情況下，受到作用時間延長的影響，抑制效果增強十分明顯，體現(xiàn)出TEC 對時間、劑量的依賴性。在各實驗組中，針對SMMC7721細胞生長，均存在抑制作用，效果顯著。以實驗組、溶媒對照組形成對比，針對HepG2細胞生長，TEC抑制作用相對較弱。

在SMMC7721 細胞中，選擇16μMTEC 作用其中，在48 小時、72 小時后，觀察細胞生長抑制率，48 小時為26.46%，72 小時為47.18%。選擇25μMTEC 作用其中，在48 小時、72 小時后，觀察細胞生長抑制率，48 小時為45.73%，72 小時為72.77%。在HepG2細胞中，將16μMTEC作用其中，在48小時后，觀察其抑制作用，可發(fā)現(xiàn)其并不具有顯著性，而將64、125、250μMTEC 作用其中，在48 小時后，呈現(xiàn)出較為明顯的抑制作用。在72 小時后，抑制作用出現(xiàn) 增加趨勢。其中，64μM 為7.26%，125μM 為37.59%，250μM為56.56%。

圖2 在SMMC7721 細胞生長中TEC 的影響。*表示對比溶媒對照組，48h 后差異顯著，P＜0.01.#表示對比溶媒對照組，72h后差異顯著，P＜0.001。

圖3 在HepG2 細胞生長中TEC 的影響。*表示對比溶媒對照組，48h 后差異顯著，P＜0.05，#表示對比溶媒對照組，72h 后差異顯著，P＜0.05。

3 結(jié)論

結(jié)合世界上各類惡性腫瘤，肝細胞癌特點較為突出，其屬于臨床中常見疾病。在我國基于惡性腫瘤，在死亡率方面，肝癌位居第二位，在發(fā)病率方面，位居第三位。針對肝癌診斷，常見臨床指標包括AFP、超聲檢查等，還包括CT、磁共振成像、肝穿刺活檢等，通過聯(lián)合肝癌高危因素，實現(xiàn)對肝癌的有效診斷[4]。以肝癌患者治療效果提升作為出發(fā)點，完成對相關(guān)高危人群的早期篩查屬于關(guān)鍵性步驟，能夠促進在早期發(fā)現(xiàn)肝癌，落實對其的診斷以及治療工作。基于肝癌監(jiān)測，其主要指標為AFP，在肝癌高危人群中，AFP、超聲檢查是主要的早期篩查手段，在檢查中，建議間隔時間應(yīng)控制在6 個月左右[5]。結(jié)合肝癌，中國屬于高發(fā)地區(qū)，就目前而言，其發(fā)病仍處于上升趨勢，需要借助有效防治手段，實現(xiàn)對肝癌的控制，由此可見，抗肝癌藥物的研究具有必要性。在腫瘤治療中，中醫(yī)手段歷史悠久，其價格相對較為低廉，在低毒副作用方面優(yōu)勢顯著。相關(guān)研究[6]均表明，為實現(xiàn)抗腫瘤藥物的高效性、低毒性，可以中草藥作為著手點，有學(xué)者[7]強調(diào)，相當一部分中草藥均具有腫瘤抑制作用。以現(xiàn)代技術(shù)發(fā)展作為背景，中醫(yī)藥也得到了一定的進步，中藥的認可度在全球范圍內(nèi)得到了有效提升。以復(fù)方丹參滴丸為例，其在腫瘤治療臨床應(yīng)用中，效果十分顯著，有效實現(xiàn)了對患者生存時間的延長，使其生存質(zhì)量得以改善。總體而言，傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有系統(tǒng)抑制腫瘤生長的作用，這也是其在肝癌治療中的重要優(yōu)勢。

以分子、基因?qū)用嬲归_分析，基于抗肝癌，中藥所具有的藥效作用機制已經(jīng)成為行業(yè)內(nèi)關(guān)注的重點。在中藥復(fù)方中，受到其致病機制復(fù)雜性的影響，使研究思路更具有獨特性[8]。天然茶葉屬于中藥成分，在茶氨酸中，其存在藥理活性種類較多，并且無毒副作用，在安全性方面優(yōu)勢明顯，因此，目前常用在食品工業(yè)中，作為添加劑使用。但是，針對茶氨酸，其在抗腫瘤藥理作用方面相對較弱，因此，本文主要以茶氨酸化合物茶乙香酰胺作為研究對象，對其在肝癌細胞生長方面產(chǎn)生的影響進行分析，可發(fā)現(xiàn)其抑制作用相對較強。通過將TEC 應(yīng)用在臨床中，可有效實現(xiàn)對癌細胞生長的抑制，完成對其的遷移、誘導(dǎo)，最終使癌細胞凋亡。結(jié)合癌細胞的生長與遷移，基于TEC的抑制作用，具體還與VEGFR/AKT/NF/kB 信號通路密切相關(guān)。本文主要圍繞肝癌細胞生長，基于茶乙香酰胺，對其抑制作用予以證實，但是針對VEGFR/AKT/NF/kB 信號通路相關(guān)性方面，還尚待進一步研究。

結(jié)合本文實驗，借助MTT 比色法，完成TEC 在HepG2 細胞生長中的影響以及在SMMC7721 細胞生長中的影響。基于MTT，作為黃色染料，在活細胞線粒體中，可將琥珀酸脫氫酶予以還原，形成紫色甲臜，具有不溶性，并在細胞中沉積。在死細胞中，將不具有這種還原性。在甲臜溶解中，其主要借助二甲基亞砜完成，并應(yīng)用酶標儀，完成對其吸收值的測定，可將活細胞相對數(shù)量予以間接形式反映。在本文研究結(jié)果中，基于SMMC7721細胞、HepG2細胞生長，TEC 起到的抑制作用十分顯著，并且對劑量、時間存在依賴性，該項研究結(jié)果也為后續(xù)研究奠定了一定的基礎(chǔ)。就茶氨酸而言，其來源具有廣泛性，價格相對較為低廉，對其進行結(jié)構(gòu)改造，可有效實現(xiàn)抗腫瘤活性的提升，其相關(guān)抗腫瘤藥物的開發(fā)前景十分廣闊。