基于CRISPR-Cas9基因編輯技術的茶葉育種研究

陳潤儀

（黑龍江大學，黑龍江哈爾濱150000）

我國作為茶葉大國，對于茶葉具有很高的需求量，盡管我國擁有的茶園面積在世界中排名前列，但真正能夠培育出優質茶葉的茶園不多。因此，在市場中經常會出現優質茶葉供不應求的現象，導致優質茶葉的價格一升再升[1]。為能夠培育出更多優質的茶葉，茶葉育種是實現這一目標的有效途徑。隨著我國農業現代化的步伐不斷加快，必須充分認識到生物科學技術為茶葉育種帶來的新機遇與新挑戰。我國針對茶葉育種的研究起步較晚，且未結合先進的技術作為支持，導致在實際茶葉育種過程中存在茶葉育種成活率低的現象。因此，對于茶葉育種方法的優化設計是具有現實意義的，有理由以提高茶葉育種成活率作為茶葉育種方法優化設計分主流方向。CRISPR-Cas9 基因編輯技術作為一種基因治療技術，能夠基因角度出發，通過DNA 剪接的技術，進而達到治療的目的[2]。基于此，有理由將CRISPRCas9 基因編輯技術應用在茶葉育種中，本文通過基于CRISPRCas9 基因編輯技術設計一種新型茶葉育種方法，致力于從根本上提高茶葉育種的成活率，為栽培出更多優質的茶葉提供方法支持。

1 CRISPR-Cas9基因編輯技術

CRISPR-Cas9 基因編輯技術最早是由EditasMedicine 公式研發而來的，該項技術最初研發的目的是為了治療肺癌所誕生的，并且取得了一定的成果。隨著該基因編輯技術的不斷完善發展，被廣泛應用到由于基因遺傳所導致的疾病中，通過剪接DNA 的方式，起到治療效果[3]。CRISPR-Cas9 基因編輯技術治療的核心理念就是通過長期的干擾，使細菌能夠形成適應性免疫防御，進而抵抗外來病毒的入侵。由此可見，該基因編輯技術能夠通過轉基因的方式，將基因敲除，通過染色體重組的方式加以代替。

CRISPR-Cas9 基因編輯技術在不斷的設計改進中，能夠適應更多更為廣泛的領域。CRISPR-Cas9 基因編輯技術在植物領域中的應用已經不是首次提出，早于2016 年就有學者該基因編輯技術應用在水稻育種中，并且能夠提高水稻育種的存活率。CRISPR-Cas9 基因編輯技術相比于普通基因編輯技術在植物領域中應用最明顯的優勢在于，CRISPR-Cas9 基因編輯技術能夠實現多位點基因頂點敲除，而普通基因編輯技術只能進行單位點基因頂點敲除。且CRISPR-Cas9 基因編輯技術在遺傳方面相比于普通基因編輯技術穩定性更高，能夠精準控制外源基因插入位點，具備外源基因可分離的特性。本文認為CRISPR-Cas9基因編輯技術在水稻育種中的應用與茶葉育種具有一定的相似性。因此，基于CRISPR-Cas9 基因編輯技術的茶葉育種方法，具體設計內容，如下文所述。

2 基于CRISPR-Cas9基因編輯技術的茶葉育種方法

本文基于CRISPR-Cas9 基因編輯技術中的DNA 剪接方式，優化設計茶葉育種方法。其核心思想在于通過敲除茶葉育種致死基因，敲入茶葉育種優質基因的方式，實現實現茶葉優質育種。針對本文設計的基于CRISPR-Cas9 基因編輯技術的茶葉育種方法具體研究內容，詳見下文。

2.1 CRISPR-Cas9基因編輯技術敲除茶葉育種致死基因

在茶葉育種過程中，必然會存在很多因素，制約茶葉育種的存活率，主要包括：BEL 以及啟動子sgR-NA，可以將其統稱為茶葉育種的致死基因[4]。為提高茶葉育種的存活率，本文基于CRISPR-Cas9基因編輯技術，通過DNA剪接的方式，敲除茶葉育種致死基因。其具體流程為，首先，可以選取一個茶葉育種樣本，通過構建載體，用于表達茶葉的愈傷組織，觀察其在育種過程中是否存在缺失突變。而后，一旦發現在育種過程中，存在缺失突變就可以運用CRISPR-Cas9 基因編輯技術中的E-CRISPRTest 工具，進行多位點基因頂點敲除。在此過程中，針對同一種類的茶葉育種致死基因可以進行多位點基因頂點敲除，針對不同種類的茶葉育種致死基因也可以運用CRISPR-Cas9 基因編輯技術中的E-CRISPR工具，進行單位點基因頂點敲除[5]。最后，在確保茶葉育種中致死基因被完全敲除的前提下，為下文敲入茶葉育種優質基因奠定良好的基礎。

2.2 CRISPR-Cas9基因編輯技術敲入茶葉育種優質基因

在基于CRISPR-Cas9 基因編輯技術敲除茶葉育種致死基因的基礎上，本文通過敲入茶葉育種優質基因的方式，進一步提高茶葉育種的成活率[6]。首先，運用CRISPR-Cas9 基因編輯技術，將sgRNA：pcoCas9茶葉育種優質基因導入茶葉樹苗。再通過酶切位點的628bp為茶葉育種提供同源序列供體，敲入茶葉育種優質基因，并將其作為茶葉育種的外源基因。在此基礎上，還需要在茶葉育種中的ADHI位點插入抗性編碼基因，使其能夠形成適應性免疫防御。最后，運用CRISPR-Cas9 基因編輯技術中的CRISPR-Direct 工具，精確控制外源基因插入位點，保證茶葉育種優質基因敲入的過程為穩定遺傳的過程。

2.3 實現茶葉育種

通過CRISPR-Cas9 基因編輯技術敲入茶葉育種優質基因，實現高質量的茶葉育種[7]。在此過程中，必須注意的是基于CRISPR-Cas9 基因編輯技術敲入的茶葉育種優質基因，在本質上具備可分離的特點，也就是說能夠實現非末端同源連接。因此，可以針對不同茶葉品種，選擇與其匹配度最高的優質基因作為外源基因敲入。與此同時，也可以應用該基因編輯技術嘗試培育新樹種，在原有茶葉樹種的基礎上加以升級，進一步提高茶葉育種的成活率。以此，實現基于CRISPR-Cas9 基因編輯技術的茶葉育種。

3 實例分析

3.1 實驗準備

本次實驗選擇某茶葉樹種作為實驗對象，實例分析內容為測試茶葉育種的成活率。本文共選取同一種類的茶葉樹苗1000株，分為實驗組與對照組，每組各500 株。針對實驗組的茶葉育種采用CRISPR-Cas9 基因編輯技術，針對對照組的茶葉育種采用普通育種方式。通過該計算實驗組與對照組的茶葉育種成活率，判斷兩種茶葉育種方法在現實應用中的可行性。設茶葉育種成活率的計算表達式為p，則有公式（1）。

公式（3）中，e 指的是茶葉育種成活數量，單位為株；U 指的是茶葉育種總數，在本次實驗中每組設定為500 株。通過公式（1），計算出實驗組與對照組的茶葉育種成活率。在此次的實驗中，以每100 株茶葉樹種為一個記錄節點，通過同組茶葉育種成活率相加求平均值的方式，求得其整組的茶葉育種成活率，記錄實驗結果。

3.2 實驗結果分析與結論

將計算后得出的茶葉育種成活率匯總，整理實驗結果，如表1所示。

表1 茶葉育種成活率對比表

通過表1可得出如下的結論：本文設計方法茶葉育種成活率明顯高于對照組，體現出設計方法在實際應用中的價值，證明其值得被大力推廣。

4 結束語

本文通過實例分析的方式，證明了設計茶葉育種方法在實際應用中的適用性，以此為依據，證明此次基于CRISPR-Cas9 基因編輯技術優化設計的必要性。因此，有理由相信通過本文設計，能夠解決傳統茶葉育種中存在的缺陷。但本文同樣存在不足之處，主要表現為未對本次茶葉育種成活率測定結果的精密度與準確度進行檢驗，進一步提高茶葉育種成活率測定結果的可信度。這一點，在未來針對此方面的研究中可以加以補足。與此同時，還需要對茶葉育種方法的優化設計提出深入研究，以此為提高茶葉育種質量提供建議。