微流控LAMP技術在呼吸道病原體檢測中的臨床應用進展*

楊家樹，戚麗華，吳 方，袁永陽 綜述，劉 杰，△ 審校

(1.南方醫科大學第二臨床醫學院，廣東廣州510280；2.中國人民解放軍總醫院第七醫學中心檢驗科，北京 100700；3.陸軍第九五七醫院檢驗科，西藏阿里 859000)

呼吸道感染是一種呼吸系統的常見病，在季節變換期間更容易發生。流感病毒也極易感染人群，從而引起流感的暴發。目前病原微生物從鑒定到藥物敏感性檢測，其過程一般是2～3 d，結核桿菌的培養檢測通常要14～35 d，這很難滿足臨床對致病菌快速診斷的要求[1]。由于核酸分子檢測的高特異度和高靈敏度的特點，近年來隨著核酸擴增技術的快速發展，越來越多的新型擴增技術也發展起來。微流控技術和環介導等溫擴增(LAMP)技術的結合，使得微流控LAMP技術不僅具有PCR技術的高靈敏度和高特異度，同時操作過程變得十分簡單，特別適用于基層醫院和偏遠地區。但核酸提取速度是制約微流控LAMP技術發展的重要因素，快速核酸提取的發展會進一步提高微流控LAMP技術的發展前景。

1 微流控芯片和LAMP技術原理

1.1微流控技術 20世紀末微流控技術研究開始發展，它是由微結構和微通道組成，運用了微電機系統、微流體技術、生物、化學等多方面技術。它可以在微納米級別的空間內精確操控微尺度流體。微流控芯片又叫“微流控芯片實驗室”，它可以巧妙地把整個分析過程的基本操作集成到一片微米尺寸的芯片上，自動完成分析的全過程，具有規模集成、儀器微小化，節約試劑等眾多優點，特別適用于即時診斷(POCT)和基層工作單位[2]。

1.2LAMP技術 自日本學者NOTOMI等[3]首次發布了LAMP技術以來，該技術發展迅速，其原理是通過對目標基因的6個特異區域設定4種引物，在恒溫條件下依賴一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，生成自我循環擴增的頸環結構，使得目標基因在短時間內大量、高效地擴增。該技術具有較高的靈敏度和特異度，且速度快，只需要1 h左右即可檢測出病原菌，比傳統PCR技術節約時間，可以滿足臨床上快速檢查病原菌感染的要求；同時它所需要的設備比較簡單，只需要一個恒溫箱，這大大減低了對大型實驗室儀器的依賴，更易于在基層醫院開展分子檢測。

1.3微流控芯片和LAMP技術的結合檢測 微流控芯片可以減少對實驗場地和大型實驗儀器的依賴性。LAMP技術則可以從分子方面更加準確地診斷呼吸道感染的病原體。微流控和LAMP技術的結合，增加了儀器的便攜性，可以節約時間和試劑，同時對病原體的快速檢測有助于臨床診斷和指導臨床醫生針對性用藥，也避免了LAMP技術氣溶膠的污染[1,4]。在金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌的檢測中，有研究證明微流控LAMP技術均有較高的靈敏度[5-6]。在兒童感染性呼吸道病原體方面，與應用較多的傳統痰培養和血清學方法相比，微流控LAMP芯片法具有較高的檢出率[7]。

2 微流控LAMP技術在呼吸道感染疾病病原診斷的臨床應用

呼吸道感染在臨床呼吸內科中的發病率總是居高不下，呼吸道感染疾病按致病菌分為3類：細菌性感染、真菌性感染和病毒性感染。微流控LAMP技術作為一種快速核酸擴增技術，特別適用于臨床病原菌的快速診斷[8]。

2.1微流控LAMP技術在細菌感染中的應用 LAMP技術較早地應用于結核分枝桿菌的診斷，傳統結核分枝桿菌的鑒定通常依賴于羅氏培養基，但是其培養時間較長，不利于臨床的早期診斷。SEKI等[9]利用LAMP技術檢測結核分枝桿菌的共有基因hspX診斷其感染。大部分微流控LAMP技術只能證明病原體的存在，不能區分菌體是否存活及反映病原體感染性強弱[10]，因為即使細菌死亡，其DNA依然存在于人體內，因此對臨床用藥劑量指導和判斷是否為急性感染有一定的限制。WU等[10]認為可以通過RT-LAMP檢測結核分枝桿菌的16S rRNA基因，區分出存活狀態的結核分枝桿菌。支原體肺炎是社區感染性肺炎的常見病原菌，研究表明檢測支原體時，LAMP技術的靈敏度和特異度分別為100.0%、94.3%[11]。有學者證實了LAMP技術在金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和流感嗜血桿菌檢測中的應用[12-15]。

2.2微流控LAMP技術在呼吸道病毒感染中的應用 LAMP技術通過逆轉錄形成的RT-LAMP技術可以用于呼吸道病毒的快速檢測。高杰等[16]利用RT-LAMP技術檢測了甲型H1N1、季節性H1N1和季節性H3N2亞型流感病毒及乙型流感病毒，結果顯示RT-LAMP技術在流感病毒檢測中與熒光定量PCR技術具有相當的靈敏度和特異度。MU等[17]利用人類呼吸道合胞病毒(HRSV)A組和B組特異的引物，分別擴增HRSV的N和L基因，設計出逆轉錄環介導等溫擴增(RT-LAMP)測定法，1 h內可以同時檢測A和B兩組HRSV，較為快速方便。

2.3微流控LAMP技術在真菌感染中的應用 侵襲性真菌感染大多是繼發性，臨床對其缺乏可靠性的病原學診斷[18]。LAMP技術作為一種分子診斷技術，在侵襲性真菌的快速診斷方面有著廣闊的應用前景。肖晶晶等[19]針對白色念珠菌的RPS0基因，利用LAMP技術建立了檢測白色念珠菌的診斷方法，其檢測的靈敏度和特異度分別為87.62%和88.33%，均高于PCR法。

3 微流控LAMP技術的技術缺陷及快速核酸提取改進技術

微流控和LAMP技術的結合大大簡化了操作步驟，提高了該技術的應用范圍。但微流控和LAMP本身的技術缺陷制約了該項技術發展，同時不能有效簡化核酸提取技術也限制了其應用[20]。

3.1微流控LAMP技術的技術缺陷 LAMP技術自發明以來因其具有較高的靈敏度和特異度、檢測速度快的優點而備受歡迎，但因其引物設計復雜，擴增需要多對引物容易引起非特異性擴增，使得假陽性率較高[20-22]。 在檢測致病菌DNA或者RNA時，大部分微流控LAMP技術檢測結果多為定性而不能定量，所以目前不能有效反映病原體感染性強弱[10]。微流控LAMP技術多以微流控芯片為基礎進行巧妙結合，一定程度上增加了其實用性。目前微流控技術因其精確的微型流體控制技術而被廣泛應用，但在制備過程中由于技術受限、芯片對生化試劑有吸附作用等因素在一定程度上限制了其推廣范圍[4,23]，而且在集成樣本核酸提取方面，由于難以精確控制氣壓使得樣本的核酸提取仍然是一個難以解決的關鍵問題。不過微流控技術依然是最有希望將核酸提取、擴增和檢測集成為一體的技術[1,4,22]。

3.2微流控LAMP的快速核酸提取技術 LAMP作為新型核酸擴增技術，依賴其檢測特點在呼吸道致病菌快速檢測中發揮重要作用。在下呼吸道感染中檢出率和靈敏度均高于普通痰培養[24]。目前LAMP技術主要困難在于病原體核酸的快速提取。在進行病原體檢測時，不能簡化核酸提取，也限制了LAMP技術在病原體檢測中的應用[4]。常用的核酸提取方法包括：煮沸法、細胞裂解法、柱式過濾法和磁珠法。進行提取DNA時，煮沸法和細胞裂解法方便、經濟、操作簡單，提取過程中沒有DNA的損失；柱式過濾法和磁珠法可以有效清除干擾PCR擴增的物質，同時提取核酸純度高，但是過濾法在DNA損失方面比磁珠法更嚴重，同時在不同濃度、不同菌種的條件下，細胞裂解法的Ct值更小[25]。近些年有學者對這幾種核酸提取技術進行簡化，一定程度上提高了微流控LAMP技術的實用性。

趙升等[26]通過一種快速核酸提取試劑檢測流感病毒時得到較高的提取效率，與離心柱法和磁珠法相比PCR結果相似。該提取試劑所有成分均在一管中，通過加熱裂解液破壞病毒外殼，釋放核酸，核酸穩定劑防止核酸降解，裂解成分降解后，核酸分布于提取液上層，整個過程只需加熱和震蕩2個步驟，時間為4 min。KAWANO等[27]采用超快速提取(PURE)試劑盒，它的作用方式是使用一種吸附粉末，移除樣品中的DNA抑制劑，達到保護樣品DNA的目的，不需要復雜的設備即可在臨床樣品中分離DNA。孫魁[28]利用堿裂解法與紙基核酸提取技術，建立了堿裂解法結合紙基核酸純化的樣本處理體系(ALP FINA)，原理是利用強堿使核蛋白、核酸酶變性，使得DNA釋放，利用過濾膜進行過濾得到核酸提取液，15 min左右即可得到提取液，整個過程不依賴電力、加熱和離心，可以方便地達到核酸提取，可用于恒溫擴增技術。

4 小結與展望

LAMP技術因其恒溫擴增，操作簡單，高靈敏度和高特異度的優點而被越來越廣泛地應用。微流控的應用減少了常規檢測對大型儀器和場地的依賴性。微流控LAMP技術鑒定致病菌因具有快速、高靈敏度和特異度的特點在臨床呼吸道感染中擁有較大的應用前景。微流控LAMP技術的結合不僅簡化了操作步驟，使得核酸分子檢測技術易于操作，同時也解決了LAMP技術的一些弊端。但是快速提取核酸仍然是目前限制微流控LAMP技術發展的因素，其次微流控和LAMP法的本身技術缺陷以及結果不能定量也限制了其臨床應用。隨著科學研究的不斷深入，微流控LAMP技術不斷地改善和發展，它在病原體檢測方面將會發揮更大的作用。