microRNA在三陰性乳腺癌轉移中的作用*

王舒淇 綜述，王東生,2△ 審校

(1.川北醫學院醫學檢驗系,四川南充 637000；2.電子科技大學醫學院附屬腫瘤醫院/四川省腫瘤醫院研究所檢驗科，四川成都 610041)

乳腺癌是臨床常見的一種惡性腫瘤，據國家癌癥中心發布的2018年全國癌癥報告顯示，乳腺癌位居全國女性癌癥發病首位。盡管靶向治療及個體綜合治療發展迅速，乳腺癌仍然是當今女性癌癥死亡的主要原因[1]。通過分析乳腺癌基因表達，將乳腺癌分為管腔上皮A型(LuminalA型、ER+或PR+、HER-2-)、管腔上皮B型(LuminalB型、ER+或PR+、HER-2+)、HER-2過表達型(ER-或PR-、HER-2+)、基底樣型(Basal-like型、ER-或PR-、HER-2-)和正常乳腺樣型[1-2]。其中基底樣型也稱三陰性乳腺癌(TNBC)，該類患者由于缺乏激素受體及人表皮生長因子受體，對激素治療及靶向治療均反應甚微，因此其5年生存率較其他類型乳腺癌患者低。此外TNBC更易發生于年輕女性患者，且具有高度轉移性，可在3年內復發，遠處轉移常見于腦、肝、肺等[3]。為了能在早期發現TNBC的轉移，改善預后,進而提高其患者生存率，研究者需要對轉移相關信號通路及生物標志物有更多的了解及認識。microRNA(miRNA)是內源性非編碼RNA，已被眾多研究證實可參與細胞分化、增殖、代謝及凋亡等生物學過程。同樣，在癌癥發生、發展的過程中，miRNA的表達情況與疾病的發展也有著千絲萬縷的聯系，其中包括腫瘤轉移。

1 miRNA的生物合成

miRNA是長度約為22～25個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA[4]，通過與其靶mRNA分子的3′端非翻譯區(3′UTR)結合，從而發揮轉錄后調控的作用。miRNA合成首先發生在細胞核內，在RNA聚合酶Ⅱ的參與下，miRNA的編碼基因轉錄為長鏈初始轉錄產物(pri-miRNA)，之后由Drosha/RNaseⅢ識別，剪切為發卡狀結構的miRNA前體(pre-miRNA)[5]；隨后被轉運蛋白Exportin5轉運至胞質內，被特異性的內切酶RNase Ⅲ Dicer裂解，最終形成成熟的miRNA[6]。miRNA與其靶標基因的mRNA互補程度決定了miRNA的作用結果，完全互補配對時miRNA會導致mRNA發生降解，而不完全互補配對時只能抑制靶基因mRNA的翻譯，不影響靶基因mRNA的穩定[7]。自發現miRNA后的20多年間，癌癥成為了該領域研究重點，許多研究發現miRNA參與了腫瘤生長、侵襲、血管生成或是免疫逃避等過程[8]。當然在TNBC的研究中，越來越多的miRNA被發現與疾病進展的關鍵過程緊密相連，如上皮細胞間質轉化(EMT)、癌細胞獲得干細胞樣特性、遷移、轉移擴散等等。目前，針對TNBC患者的有效治療手段還相當有限，但隨著miRNA研究的深入，相信其能為提示腫瘤或治療靶點做出貢獻。

2 miRNA與TNBC的關系

根據miRNA在腫瘤發生、發展中產生的不同作用，將miRNA分為腫瘤促進miRNA(onco-miRNA)和腫瘤抑制miRNA(ts-miRNA),通常onco-miRNA在腫瘤中上調，主要通過降解腫瘤抑制基因促進癌細胞生長；ts-miRNA則在腫瘤中下調，主要以癌基因為降解目標，因此具有抗腫瘤功能[3,9]。與正常組織相比，幾乎在腫瘤發生過程的所有階段(細胞周期、凋亡、侵襲、血管生成)都存在miRNA表達失調的情況。

在多項關于乳腺癌的研究中，研究者已經證實數個miRNA參與發揮作用。PEREZ-ANORVE等[10]研究表明miR-122上調可促進獲得性耐輻射乳腺癌的細胞存活，并提示miR-122具有作為腫瘤抑制因子和依賴于細胞表型的onco-miRNA的雙重功能，可在不同程度上控制對放療的反應。BASOVA等[11]應用縱向多變量數據分析隨機模型證實miR-155和miR-24可作為onco-miRNA，對早期乳腺癌復發有高度預測作用。SON等[12]報道miR-374a-5p在TNBC患者中特異性上調，可作為onco-miRNA靶向TNBC的ARRB1，從而促進腫瘤進展。另外miR-4417被發現是TNBC的腫瘤抑制因子和預后生物標志物，其表達在TNBC細胞從非惡性向惡性發展的過程中被抑制[13]。通過研究miR-4458與TNBC中SOCS1的關系，發現miR-4458直接與SOCS1結合，負調控SOCS1 mRNA和蛋白表達，從而抑制細胞增殖，促進細胞凋亡[14]。

由此可見，miRNA與TNBC存在著一定的關聯性，其表達量的變化可能成為TNBC診斷、治療或預后判斷的依據。隨著越來越多新技術，如基因圖譜和測序、蛋白質組學和miRNA分析等被用于探索包括TNBC在內的腫瘤發生和轉移，新的治療方法很有可能在不久的未來被發現。

2.1miRNA與TNBC的轉移 腫瘤轉移是惡性腫瘤細胞脫離原發腫瘤，通過淋巴、血液等轉移方式到達繼發組織或器官形成腫瘤的過程，是一個多步驟、多階段、連續復雜的生物學過程[15]，涉及多因素、多水平調節，其中包括腫瘤轉移基因、轉移抑制基因、細胞黏附因子、蛋白降解酶及機體免疫狀態等[16]。惡性腫瘤的轉移往往是腫瘤治療失敗,從而導致患者死亡的主要原因。隨著對miRNA研究的深入，越來越多的研究表明miRNA可通過EMT、腫瘤干細胞(CSCs)、腫瘤血管再生、腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)等途徑調控惡性腫瘤的轉移。

有研究者采用Solexa深度測序法檢測TNBC細胞及非TNBC干細胞的miRNA表達水平，通過建立裸鼠動物實驗、異種移植模型、熒光素酶報告基因分析等，證實miR-4319可以通過E2F2抑制TNBC腫瘤干細胞中腫瘤球的自我更新和形成，同時可以抑制腫瘤的轉移[17]。在腫瘤細胞和巨噬細胞相互作用的研究中發現巨噬細胞通過miRNA或外泌體參與腫瘤的發生、發展。有研究表明乳腺癌細胞可在凋亡過程中釋放高表達的miR-375，腫瘤源性miR-375可被CD36攝取，進而促進TAMs中miR-375的積累。在巨噬細胞中，miR-375可直接靶向TNS3和PXN，增強巨噬細胞向腫瘤的遷移和浸潤；而在腫瘤細胞中，miR-375通過調節CCL2的表達來增加巨噬細胞的募集[18]。此外，miR-126-3p、miR-148a/152、miR-206均被發現參與TNBC血管形成過程[19-21]。

2.2miRNA參與TNBC的EMT過程 TNBC是乳腺上皮細胞來源的惡性腫瘤，而EMT可使上皮細胞來源的腫瘤細胞獲得較強侵襲和轉移能力,從而導致腫瘤的浸潤、侵襲和轉移。在EMT誘導過程中，多種信號通路(如Wnt/β-catenin通路、TGF-β信號通路、Notch、PI3K等)，可通過影響SNAIL1、SNAIL2、TWIST、ZEB1、ZEB2等轉錄調控因子，最終引起間充質標志物(如Vimentin、N-cadhefin等)表達上調，上皮標志物(如E-cadherin、zonula occluden-1等)表達下調[22-23]。許多研究表明miRNA可通過參與調節信號通路或轉錄調控因子在EMT過程中發揮作用。

miR-200家族(包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429)是被許多研究所證實的，在TNBC EMT過程中發揮負性調控作用的因子[24]。研究表明miR-200是癌細胞上皮表型的一個標志物,miR-200可直接靶向和下調E-cadherin轉錄抑制因子ZEB1和ZEB2[25]，導致乳腺癌細胞上皮表型的恢復,而抑制miR-200可降低E-cadherin的表達并增加波形蛋白的表達，從而誘導EMT[26-27]。有研究表明miR-200a可以抑制TNBC的遷移[28]；miR-200b可以抑制TNBC的EMT過程及遷移[29]；miR-200c可通過下調β-catenin和Vimentin，進而調節Wnt信號通路相關基因，最終抑制TNBC的EMT過程[30]。然而，miR-200家族在乳腺癌轉移中的作用卻存在爭議。有研究者發現miR-200在小鼠乳腺癌細胞系中的過表達表現出促進遠處轉移[31]。所以，盡管越來越多的證據表明，miR-200家族調節E-cadherin的表達并參與EMT過程，但這并不一定能直接表明其能預測其侵襲性和轉移潛能。顯然，這其中的機制需要更深入、更系統的研究，才能確定該家族在腫瘤轉移中的作用。

miR-124在肝癌細胞中通過靶向ROCK2和EZH2體外抑制EMT發生和張力纖維形成，體內抑制腫瘤肝臟和肺轉移[32]。而在TNBC細胞中miR-124通過靶向ZEB2降低其侵襲、轉移率，并抑制EMT過程[33]。表明同一miRNA在不同腫瘤中可發揮同樣的抑制EMT過程的作用。

研究通過比較miR-125b在乳腺癌和正常乳腺組織中的表達，發現miR-125b在乳腺癌中的表達下調，提示miR-125b是乳腺癌的ts-miRNA，并發現其可能是通過靶向erbB2/erbB3通路或ETS1基因發揮作用[34-35]。然而又有研究者發現miR-125b在TNBC細胞MDA-MB-468中的表達明顯上調，抑制miR-125b在MDA-MB-468細胞中的表達后，細胞增殖、侵襲性和遷移能力均有降低，因此，miR-125b又可作為TNBC的onco-miRNA[36]。由此可見，同一miRNA在同一腫瘤的不同亞型中可能發揮著截然相反的作用。

近來miR-30a被發現在TNBC中表達下調，其表達的降低與組織學分級和淋巴結轉移有關,通過免疫熒光實驗證實miR-30a的過表達增加了上皮標志物E-cadherin的表達，降低了間質標志物N-cadherin和vimentin的表達；而熒光素酶實驗證實miR-30a特異性靶向ROR1，從而抑制TNBC細胞在體內外的侵襲和轉移[37]。而另一項研究卻觀察到乳腺癌細胞中miR-30a的表達降低與p53失活有關，進而證明p53/miR-30a/ZEB2軸控制腫瘤細胞的侵襲和遠端擴散，并影響miR-200c的表達[38]。這表明同一miRNA在同一腫瘤發展過程中可通過不同作用靶點調節EMT過程。

隨著miRNA研究熱度逐漸升高，越來越多的miRNA被發現在TNBC細胞EMT過程中發揮作用。例如，最新的一些研究表明miR-212-5p可通過下調Prrx2抑制TNBC獲得EMT表型，從而抑制腫瘤進展過程中的細胞遷移和侵襲[39]；miR-3178通過靶向降低Notch1的表達，參與EMT，抑制TNBC細胞的增殖、侵襲和遷移[40]；miR-508-3p通過調控ZEB1表達，顯著抑制TNBC細胞EMT過程[41]。這些發現均證實miRNA可作為重要的調控因子，介導EMT的發生，抑制腫瘤轉移。

3 循環miRNA可預測TNBC轉移

實驗已經證實miRNA參與TNBC轉移過程，在一定程度上能為TNBC早期轉移提供依據，但患者于治療過程中，反復行病理活檢監測評估病情并不可行，此時一種可反復操作、微創且易于被患者接受的方法被研究者提出，即檢測血清中的miRNA[42]。KLEIVI等[43]證實，血清中miR-18b、miR-103、miR-107和miR-652高水平與TNBC患者原發腫瘤切除后36個月內的腫瘤轉移復發相關。又有研究通過與健康對照組比較，發現TNBC患者血清miR-940表達顯著下調， miR-940低表達的TNBC患者總體生存率較miR-940高表達的TNBC患者低，且該miRNA水平與淋巴結轉移和TNM分期有關[44]。同時，有研究者采用實時PCR技術檢測血清中乳腺癌相關miRNA水平，發現miR-122、miR-21、miR-155在乳腺癌患者中表達明顯增加，miR-126明顯降低，且miR-122可在一定程度上提示轉移；相較于使用酶聯免疫吸附法測定血清CA15-3和CEA有更高的靈敏度，且與臨床分期及組織學分級有更顯著的相關性[45-46]。由此可見，循環中存在著提示TNBC轉移的miRNA,但其在臨床應用中的價值還需要接受更大規模臨床病例的驗證。

4 小 結

TNBC作為乳腺癌預后較差的一個類型，其缺乏特異性的靶向治療藥物且轉移復發率高，導致患者病死率居高不下，因此備受關注。經過眾多學者的不懈努力，發現miRNA不僅可作為TNBC分子特征，利于研究者對TNBC進行分型；另一方面miRNA更是一種易于檢測的分子標志物，可用于TNBC的病情監測或治療指導。通過綜述miRNA在TNBC EMT調控轉移過程可看出，EMT受到不同轉錄因子及信號通路的調控，而miRNA可通過多種途徑參與其中，并且主要表現出抑制腫瘤的作用。

目前，許多miRNA被發現在腫瘤的體內或體外實驗中發揮致癌或抑癌作用，但實際上其并沒有發揮真正的診斷或臨床治療價值，并且在腫瘤轉移過程中發揮作用的miRNA尚未被完全發現，但是理解并運用這些潛在的調控位點，尋找其上游或下游的作用基因，探討其聯合作用的臨床價值，可以增強對腫瘤轉移的認識,有利于找出早期提示腫瘤轉移的標志物或控制腫瘤轉移的有效途徑。

作為檢驗工作者，無論是組織標志物(如尿激酶纖溶酶原激活劑、纖溶酶原激活劑抑制劑、組織蛋白酶D)、遺傳標志物(如BRCA1、BRCA2、DNA倍性)、血清標志物(如CA-549、MCA、MUC-1)[47]，亦或是循環miRNA,研究者期望能夠通過改進實驗方法，發現利于早期診斷乳腺癌或提示乳腺癌轉移的高特異度、高靈敏度標志物。例如，LEE等[48]利用等離子體頭部植絨金納米柱的表面，增強拉曼散射傳感器，定量、特異地檢測乳腺癌外泌體miRNA，得出一種高選擇性、高靈敏度的檢測外泌體miRNA的方法，對早期腫瘤診斷有重要意義，從而在腫瘤發生早期或腫瘤轉移早期提示臨床，達到改善患者預后的期望。