錦燈籠中酸漿苦素類成分的分離與鑒定

夏天乙，鐘仁興，丁子禾，楊燕妮，王武靜，王毅，劉禹熙，商立峰，舒尊鵬

(1.廣東省中藥飲片規(guī)范化炮制工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006； 2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 3.廣州峰華舒寶生物科技有限公司，廣東 廣州 510006； 4.廣東安道醫(yī)療器械有限公司，廣東 佛山 528200)

錦燈籠是茄科酸漿屬多年生草本植物，果實(shí)、根及全草皆可入藥，味酸、苦，性寒，具有清熱、解毒、利咽化痰、利尿通淋等作用，用于咽痛、音啞、痰熱咳嗽、小便不利，外治天皰瘡、濕疹[1]。目前，已知錦燈籠中含有甾體類、黃酮及其苷類、苯丙素類、生物堿類和脂肪酸類等多種活性成分[2]。甾體類成分中的酸漿苦素類化合物是錦燈籠中主要的活性化合物，日本學(xué)者在1970年從錦燈籠中分離鑒定的結(jié)構(gòu)，之后大量physalin類化合物被發(fā)現(xiàn)報(bào)道[3]。相關(guān)藥理實(shí)驗(yàn)表明，此類化合物具有抗菌、抗感染[4]、體外抗腫瘤細(xì)胞增殖和體內(nèi)抗腫瘤移植性[5]等多種生物活性。

為更深入探究此類活性化合物，本課題組對(duì)錦燈籠的50%乙醇提取物進(jìn)行了更為系統(tǒng)的化學(xué)成分提取分離研究，分離鑒定了7個(gè)化合物，為錦燈籠中酸漿苦素的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了參考依據(jù)。

1 儀器與材料

德國Bruker AM-400型核磁共振波譜儀；美國Nicolet公司的Magna FTIR-750型傅立葉變換紅外光譜儀；美國Thermo Finnigan公司MAT-95型質(zhì)譜儀；美國GLSCIRNCES Inc. Inertsil PREP-ODS；柱色譜硅膠和薄層色譜用硅膠(青島海洋化工有限公司)；乙醇(EtOH)、甲醇(MeOH)和二氯甲烷(CH2Cl2)等溶劑均為分析純(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

錦燈籠購自廣州市藥材市場(chǎng)，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥資源系李書淵教授鑒定為錦燈籠PhysalisalkekengiL. var.franchetii(Mast.) Makino的宿萼。

2 提取與分離

取錦燈籠6 kg，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇回流提取2次，每次2 h，減壓回收溶劑得到乙醇提取物1.5 kg，使用大孔吸附樹脂柱色譜吸附，再用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇進(jìn)行洗脫，收集第0.3～0.8 BV間的洗脫液，取洗脫物105 g進(jìn)行硅膠柱色譜，依次用CH2Cl2-MeOH(體積比9∶1)、CH2Cl2-MeOH(體積比5∶1)、CH2Cl2-MeOH (體積比1∶1)、MeOH和水進(jìn)行洗脫，洗脫至無色，分離得到9個(gè)部分P1～P9。

將P3用甲醇重結(jié)晶得到化合物1。將P4進(jìn)行硅膠柱色譜，用CH2Cl2-MeOH (體積比10∶1)洗脫，分離得到7個(gè)部分(P4-1～P4-7)，P4-4經(jīng)ODS柱色譜后用HPLC[ODS柱，流動(dòng)相MeOH-H2O(體積比40∶60)]精制得到化合物2。將P1進(jìn)行柱色譜，依次用CH2Cl2、CH2Cl2-MeOH(體積比9∶1)洗脫，分離得到3個(gè)部分(P1-1～P1-3)，P1-2用甲醇重結(jié)晶得到化合物3。P1-3經(jīng)ODS柱色譜后用HPLC(ODS柱，流動(dòng)相MeOH-H2O 45∶55)分離得到化合物4和5。將P1-3經(jīng)反相ODS柱色譜后使用HPLC(ODS柱，流動(dòng)相MeOH-H2O 60：40)精制得到化合物6。P1用甲醇重結(jié)晶得化合物7。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無定形粉末(甲醇)。ESI-MSm/z：544 [M+NH4]+，分子式為C28H30O10。1H-NMR(400 MHz，C5D5N)δ：6.04(1H，dd，J=2.0，10.4 Hz， H-2)，6.59(1H，ddd，J=2.0，4.8，10.4 Hz，H-3)，3.65(1H，dt，J=2.8，19.6 Hz，H-4a)，2.69(1H，dt，J=2.8，19.6 Hz，H-4b)，4.16(1H，br s，H-6)，2.85(2H，m，H-7)，3.13(1H，m，H-8)，4.20(1H，dd，J=8.0，10.8 Hz，H-9)，2.37(1H，m，H-11a)，1.54(1H，m，H-11b)，2.32(1H，d，J=9.2 Hz，H-12a)，1.98(1H，dd，J=9.2，15.6 Hz，H-12b)，3.13(1H，s，H-16)，1.58(3H，s，H-19)，2.29(3H，s，H-21)，4.69(1H，t，J=2.8 Hz，H-22)，2.07(2H，d，J=2.8 Hz，H-23)，2.95(1H，d，J=4.4 Hz，H-25)，4.76(1H， dd，J=4.4，13.2 Hz，H-27a)，3.98(1H，d，J=13.2 Hz，H-27b)，1.30(3H， s，H-28)；13C-NMR(100 MHz，C5D5N)δ：204.3(C-1)，127.9(C-2)，141.6(C-3)，35.6(C-4)，76.7(C-5)，73.7(C-6)，27.4(C-7)，39.0(C-8)，30.7(C-9)，54.4(C-10)，25.3(C-11)，24.9(C-12)，79.4(C-13)，107.5(C-14)，209.5(C-15)，54.8(C-16)，80.7(C-17)，172.8(C-18)，13.3(C-19)，81.1(C-20)，21.7(C-21)，76.8(C-22)，30.5(C-23)，31.9(C-24)，50.1(C-25)，166.8(C-26)，60.6(C-27)，26.1(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道的酸漿苦素D進(jìn)行比較，兩者基本一致，鑒定化合物1為酸漿苦素D(physalin D)。

化合物2：白色無定形結(jié)晶(甲醇)。UV(MeOH)λmax：228 nm，結(jié)合1H-NMR譜和13C-NMR譜，推測(cè)分子式為C28H32O11。1H-NMR(400 MHz，C5D5N)δ：6.04(1H，dd，J=2.0，10.4 Hz，H-2)，6.59(1H，ddd，J=2.0，4.8，10.4 Hz， H-3)，3.35(1H，dt，J=2.8，19.6 Hz，H-4a)，2.69(1H，dt，J=2.8，19.6 Hz， H-4b)，2.85(2H，m，H-6)，4.20(1H，dd，J=8.0，10.8 Hz，H-7)，3.13(1H，m，H-8)，4.16(1H，m，H-9)，2.37(1H，m，H-11a)，1.54(1H， m，H-11b)，2.32(1H，d，J=9.2 Hz，H-12a)，1.98(1H，dd，J=9.2，15.6 Hz， H-12b)，3.13(1H，s，H-16)，1.30(3H，s，H-19)，2.29(3H，s，H-21)，4.69(1H，t，J=2.8 Hz，H-22)，2.07(2H，d，J=2.8 Hz，H-23)，2.95(1H，d，J=4.4 Hz，H-25)，4.76(1H，dd，J=4.4，13.2 Hz，H-27a)，3.98(1H，d，J=13.2 Hz，H-27b)，1.58(3H，s，H-28)；13C-NMR(100 MHz，C5D5N)δ：203.8(C-1)，128.3(C-2)，145.1(C-3)，34.7(C-4)，78.9(C-5)，31.0(C-6)，71.6(C-7)，42.7(C-8)，31.4(C-9)，55.8(C-10)，31.0(C-11)，26.1(C-12)，80.2(C-13)，107.5(C-14)，209.5(C-15)，55.8(C-16)，81.4(C-17)，173.0(C-18)，9.5(C-19)，81.9(C-20)，22.3(C-21)，79.8(C-22)，31.4(C-23)，32.7(C-24)，50.8(C-25)，167.7(C-26)，57.2(C-27)，25.6(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的酸漿苦素E進(jìn)行比較，二者基本一致，鑒定化合物2為酸漿苦素E(physalin E)。

化合物3：白色無定形結(jié)晶(甲醇)。紫外光譜UV(MeOH) λmax：224 nm。結(jié)合1H-NMR譜和13C-NMR譜，推測(cè)分子式為28H30O9。1H-NMR(400 MHz， C5D5N)δ：6.57(1H，ddd，J=2.0，4.8，0.4 Hz，H-2)，5.85(1H，dd，J=2.8，10.4 Hz，H-3)，5.40(1H，d，J=6.0 Hz，H-6)，1.06(3H，s，H-19)，2.38(3H，s，H-21)，4.76(1H，t，J=2.8 Hz，H-22)，2.97(1H，d，J=3.6 Hz，H-25)，4.82(1H，dd，J=3.6，12.4 Hz，H-27a)，4.00(1H，d，J=12.4 Hz，H-27b)，1.32(3H，s，H-28)。13C-NMR(100 MHz，C5D5N)δ：203.2(C-1)，127.8(C-2)，145.4(C-3)，34.3(C-4)，136.1(C-5)，124.8(C-6)，30.7(C-7)，41.2(C-8)，32.9(C-9)，53.1(C-10)，25.4(C-11)，25.4(C-12)，79.9(C-13)，107.6(C-14)，209.8(C-15)，55.9(C-16)，81.9(C-17)，167.8(C-18)，17.3(C-19)，81.4(C-20)，22.6(C-21)，77.6(C-22)，30.7(C-23)，50.9(C-25)，167.7(C-26)，55.9(C-27)，25.7(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的酸漿苦素B進(jìn)行比較，二者基本一致，鑒定化合物3為酸漿苦素B(physalin B)。

化合物4：白色無定形結(jié)晶(甲醇)。UV(MeOH)λmax：226 nm。結(jié)合1H-NMR譜和13C-NMR譜，推測(cè)分子式為C28H30O10。1H-NMR(400 MHz，C5D5N)δ：6.51(1H，ddd，J=2.0，4.8 Hz，10.4，H-2)，5.86(1H，dd，J=2.8，10.4 Hz，H-3)，5.58(1H，d，J=6.0 Hz，H-6)，3.87(1H，t，J=11.6 Hz，H-7)，0.99(3H，s，H-19)，2.02(3H，s，H-21)，4.71(1H，t，J=2.8 Hz，H-22)，2.97(1H，d，J=3.6 Hz，H-25)，4.82(1H，dd，J=3.6，12.4 Hz，H-27a)，4.00(1H，d，J=12.4 Hz，H-27b)，1.70(3H，s，H-28)。13C-NMR(100 MHz，C5D5N)δ：203.4(C-1)，129.2(C-2)，146.2(C-3)，37.6(C-4)，141.3(C-5)，128.8(C-6)，64.1(C-7)，49.3(C-8)，33.9(C-9)，55.6(C-10)，32.6(C-11)，31.8(C-12)，81.8(C-13)，103.6(C-14)，215.3(C-15)，56.1(C-16)，84.2(C-17)，174.3(C-18)，15.8(C-19)，84.7(C-20)，23.0(C-21)，77.0(C-22)，33.3(C-23)，55.8(C-25)，163.8(C-26)，65.9(C-27)，31.1(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的酸漿苦素N進(jìn)行比較，二者基本一致，鑒定化合物4為酸漿苦素N(physalin N)。

化合物5：白色無定形結(jié)晶(甲醇)。UV(MeOH)λmax：226 nm。結(jié)合1H-NMR譜和13C-NMR譜，推測(cè)分子式為C28H32O10。1H-NMR(400 MHz， C5D5N)δ：6.53(1H，ddd，J=2.0，4.4，10.0 Hz，H-2)，5.78(1H，dd，J=2.4，10.0 Hz，H-3)，5.85(1H，dd，J=1.6，6.4 Hz，H-6)，3.87 (1H，t，J= 11.6 Hz，H-7)，1.46(3H，s，H-19)，2.07(3H，s，H-21)，4.70(1H，t，J=2.8 Hz，H-22)，1.23(1H，d，J=7.6 Hz，H-27)，1.00(3H，s，H-28)。13C-NMR(100 MHz， C5D5N)δ：203.4(C-1)，129.2(C-2)，146.6(C-3)，35.6(C-4)，141.3(C-5)，128.8(C-6)，64.1(C-7)，47.9(C-8)，32.9(C-9)，54.0(C-10)，30.6(C-11)，25.8(C-12)，81.9(C-13)，103.9(C-14)，217.4(C-15)，55.1(C-16)，84.3(C-17)，174.4(C-18)，15.6(C-19)，84.5(C-20)，23.1(C-21)，78.5(C-22)，29.3(C-23)，40.9(C-25)，173.8(C-26)，18.4(C-27)，30.3(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的酸漿苦素O進(jìn)行比較，二者基本一致，鑒定化合物5為酸漿苦素O(physalin O)。

化合物6：白色無定形結(jié)晶(甲醇)。UV光譜(MeOH)λmax：226 nm。結(jié)合1H-NMR譜和13C-NMR譜，推測(cè)分子式為C28H32O10。1H-NMR(400 MHz， C5D5N)δ：6.54(1H，dd，J=10.4，6.0 Hz，H-2)，5.85(1H，d，J=10.4 Hz，H-3a)，6.54(1H，dd，J=10.4，6.0 Hz，H-3b)，5.38(1H，d，J=6.0 Hz，H-6)，1.04(3H，s，H-19)，2.38(3H，s，H-21)，4.76(1H，t，J=2.8 Hz，H-22)，2.88(1H，d，J=3.6 Hz，H-25)，4.82(1H，dd，J=3.6 Hz，12.4，H-27a)，4.00(1H，d，J=12.4 Hz，H-27b)，1.31(3H，s，H-28)。13C-NMR(100 MHz， C5D5N)δ：204.8(C-1)，125.7(C-2)，139.9(C-3)，116.5(C-4)，157.9(C-5)，71.6(C-6)，33.9(C-7)，49.3(C-8)，37.6(C-9)，55.6(C-10)，31.8(C-11)，32.6(C-12)，78.1(C-13)，107.7(C-14)，209.4(C-15)，55.9(C-16)，80.7(C-17)，24.4(C-18)，16.9(C-19)，84.5(C-20)，21.5(C-21)，76.2(C-22)，33.3(C-23)，49.2(C-25)，167.1(C-26)，60.7(C-27)，24.4(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道的酸漿苦素G進(jìn)行比較，二者基本一致，鑒定化合物6為酸漿苦素G(physalin G)。

化合物7：白色無定形結(jié)晶(甲醇)。UV光譜(MeOH) λmax：226 nm。結(jié)合1H-NMR譜和13C-NMR譜，推測(cè)分子式為C28H32O10。1H-NMR(400 MHz， C5D5N)δ：5.98(1H，dd，J=1.6，10.0 Hz，H-2)，6.59(1H，dq，J=2.4，10.0 Hz，H-3)，3.00(1H，m，H-4a)，2.48(1H，m，H-4b)，5.85(1H，dd，J=1.2，10.0 Hz，H-6)，6.30(1H，dd，J=4，10.0 Hz，H-7)，2.91(1H，m， H-8)，2.98(1H， m， H-9)，2.53(1H， m，H-11a)，2.05(1H， m， H-11b)，2.91(1H，m，H-12a)，2.49(1H，m，H-12b)，3.28(1H，s，H-16)，1.00(3H，s，H-19)，2.08(3H，s，H-21)，4.73(1H，dd，J=4.4，2.4 Hz，H-22)，1.58(1H，m，H-23a)，2.02(1H，m，H-23b)，4.82(1H，dd，J=2.8，12.4 Hz， H-27a)，4.31(1H，d，J=12.4 Hz，H-27b)，1.51(3H，s，H-28)；13C-NMR(100 MHz， C5D5N)δ：204.2(C-1)，129.8(C-2)，142.8(C-3)，39.8(C-4)，74.0(C-5)，132.6(C-6)，130.3(C-7)，50.1(C-8)，33.9(C-9)，55.7(C-10)，27.4(C-11)，31.7(C-12)，81.5(C-13)，81.5(C-14)，175.2(C-15)，50.4(C-16)，85.5(C-17)，176.1(C-18)，17.8(C-19)，84.2(C-20)，23.2(C-21)，78.2(C-22)，30.8(C-23)，32.0(C-24)，42.8(C-25)，171.6(C-26)，63.0(C-27)，31.7(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的酸漿苦素P進(jìn)行比較，二者基本一致，鑒定化合物7為酸漿苦素P(physalin P)。

4 討論

本研究從錦燈籠中分離得到7個(gè)單體化合物，分別鑒定為酸漿苦素D(1)、酸漿苦素E(2)、酸漿苦素B(3)、酸漿苦素N(4)、酸漿苦素O(5)、酸漿苦素G(6)以及酸漿苦素P(7)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，酸漿苦素D能夠抑制破骨細(xì)胞生成和骨質(zhì)流失[12]；酸漿苦素B和E具有一定的抗感染、抗菌作用，并且酸漿苦素B活性較酸漿苦素E強(qiáng)[13]；酸漿苦素B和G能夠抑制淋巴細(xì)胞功能，可防止小鼠異基因異位心臟移植排斥[14]；酸漿苦素N、酸漿苦素O和P目前尚未有相關(guān)活性研究報(bào)道，有待進(jìn)一步開發(fā)利用。另外，根據(jù)本課題組的研究和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，酸漿苦素類的甾體化合物具有廣泛的藥理活性[4,15]，具有很大的開發(fā)前景。

目前，國內(nèi)尚未有統(tǒng)一的酸漿苦素類成分歸屬與鑒定的文獻(xiàn)報(bào)道，本次研究歸屬了該7個(gè)化合物的詳細(xì)譜學(xué)數(shù)據(jù)作為當(dāng)前相關(guān)研究的補(bǔ)充，以供參考。本研究內(nèi)容僅限于從錦燈籠中提取分離酸漿苦素類化合物，所獲得的化合物的藥理活性及作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。