循環腫瘤細胞用于肝細胞癌診斷和預后評估的研究進展▲

朱 鵬 覃 剛 吳莉莉

(四川省遂寧市第一人民醫院消化內科，遂寧市 629000，電子郵箱：tougaozhu001@163.com)

【提要】 肝細胞癌是臨床上常見的消化系統惡性腫瘤，預后較差。肝細胞癌的早期診斷有助于臨床早期干預，提高患者生存率。體液活檢是近年來較受關注的惡性腫瘤早期篩查診斷方法，其具有無創、準確、可重復的優點。循環腫瘤細胞(CTC)檢測屬于體液活檢技術之一，在肝細胞癌的診斷和預后評估中具有重要的臨床價值。本文就CTC在肝細胞癌診斷和預后評估中的應用價值進行綜述。

肝細胞癌是臨床上十分常見的消化系統惡性腫瘤，在全球范圍內其發病率均較高，死亡病例約占惡性腫瘤患者的8%[1]。肝細胞癌的致病機制十分復雜，與慢性肝炎病毒感染、遺傳、藥物、環境等多因素均有關[2]。在我國，由于慢性乙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒感染的廣泛流行，每年新發肝細胞癌總數為35萬～45萬人，約占全球新發肝細胞癌患者的40%，造成了嚴重的公共衛生負擔[3]。肝細胞癌通常起病隱匿，患者確診時常已處于疾病中晚期，此時缺乏有效的治療手段，因此臨床預后極差。肝細胞癌的早期篩查診斷有助于指導臨床進行針對性干預，尤其是采取根治性手術切除，從而改善患者的臨床預后[4]。

體液活檢是近年來受到廣泛關注的惡性腫瘤診斷方法，其主要是通過無創技術檢測實體腫瘤或轉移病灶釋放到外周循環中的腫瘤成分，主要包括循環腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)、循環腫瘤相關DNA及RNA、腫瘤外泌體等[5]。其中CTC檢測作為體液活檢技術的重要組成部分，在惡性腫瘤患者的診斷、預后及療效評估等方面具有重要價值。除了美國食品藥品監督管理局已批準的CellSearch?系統，目前在改進及研發更為便捷準確的CTC檢測技術方面也取得一些進展[6]。大量研究顯示，肝細胞癌細胞在疾病早期即可從實體瘤中脫離并進入外周循環而成為CTC，即使在未發生遠處轉移的情況下，肝細胞癌患者的CTC計數亦可長期處于較高水平，且CTC計數在肝細胞癌的臨床診斷及預后評估中具有較高的價值[7-8]。本文就CTC檢測應用于肝細胞癌臨床診斷及預后評估的研究進展進行綜述，為肝細胞癌的臨床診斷及預后評估提供參考。

1 CTC的檢測方法

1.1 主要檢測方法 CTC是實體腫瘤或轉移灶釋放入外周循環的腫瘤細胞，具有原發性腫瘤的生物學特性。惡性腫瘤患者的CTC計數通常極低，約109個紅細胞或106～107個白細胞中僅能檢出1個CTC，而且CTC容易聚集成微栓，這影響了CTC的檢測[9]。目前用于檢測CTC的方法主要有免疫磁性分離富集和基于形態學的分離富集。其中免疫磁性分離富集的應用最為廣泛，包括CellSearch?、NanoVelcro?、CanPatrol?、CTC-Chip、免疫磁性細胞分選儀、iFISH?、AdnaTest?檢測系統等。基于免疫反應原理，CTC分選富集方法可分為正性分選及負性分選。其中，正性分選是使用針對腫瘤相關抗原的特異性抗體，對目標CTC進行捕獲和富集；而負性分選則是利用白細胞抗原(如CD45)來去除白細胞。目前，美國食品藥品監督管理局僅批準了CellSearch?系統用于CTC的臨床檢測，其可用于乳腺癌、結直腸癌及前列腺癌患者，該技術方法能夠在分選富集CTC同時，較好地保存細胞形態結構，且商品化的半自動檢測儀可使操作流程明顯簡化，相應的技術標準也得到了臨床的驗證[10]。CellSearch?系統的檢測原理主要是通過偶聯上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)、細胞角蛋白(cytokeratin，CK)等腫瘤特異表面標志物來富集CTC。經免疫分選富集后獲得的CTC還需進一步鑒定，主要方法是固定CTC后使用4,6-二脒基-2-苯基吲哚熒光染料標記細胞核，使用CD45、CK8、CK18、CK19、Ckmix等熒光抗體標記CTC細胞，熒光顯微鏡下的EpCAM+DAPI+CD45-CK+細胞即可定義為CTC[11]。

1.2 新型或改良檢測技術 目前針對CTC檢測的臨床價值研究大多是基于CellSearch?系統進行，而新型CTC檢測技術的開發也多使用CellSearch?系統作為對照。有研究者在嘗試開發新型CTC分選富集方法以改進CTC的臨床檢測方法，并取得了一些進展。例如，Pang等[12]開發了一種新型的拉曼散射生物感受器(使磁珠表面的磁性增強)來檢測肝細胞癌患者的CTC，這種生物感受器包含2個主要組成部分，即抗脫唾液酸糖蛋白受體抗體-Fe3O4-Ag復合納米粒子及抗磷脂酰肌醇蛋白多糖3抗體-Au-Ag-5，5-二硫二硝基苯甲酸納米棒；基于臨床標本的驗證試驗結果顯示，當血液樣本中的肝細胞癌相關CTC在1～100個/mL的濃度范圍內，該系統檢測具有較好的線性相關性，具有潛在的臨床檢測價值。Xue等[13]構建了集成細胞差相富集與免疫熒光原位雜交的iFISH?檢測平臺，臨床驗證試驗顯示，iFISH?對肝細胞癌 CTC的檢測率高于CellRearch?，其檢出肝細胞癌患者的CTC計數也高于CellSearch?。Liu等[14]開發了一種基于高細胞核質比(high karyoplasmic ratio，HKR)來分選富集CTC的方法，這種方法無須使用腫瘤特異性標志物對肝細胞癌相關CTC進行標記；驗證試驗結果顯示，肝細胞癌患者外周循環中的HKR細胞計數明顯高于無肝細胞癌者，且存在微血管侵襲的患者HKR細胞計數更高，此外HKR細胞計數用于診斷肝細胞癌的受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線下面積也高于基于EpCAM+分選富集的CTC計數。上述研究結果為改進應用于肝細胞癌患者的CTC分選富集方法，提供了重要參考。

2 CTC用于肝細胞癌的臨床診斷

無創生物學指標在肝細胞癌的早期篩查及診斷中具有重要的臨床價值，其中應用最廣泛的指標是血清甲胎蛋白，國內外各大指南均推薦對肝細胞癌患者(包含疑似患者)常規檢測甲胎蛋白，并在肝細胞癌治療隨訪的全過程中將甲胎蛋白作為重點監測指標[15]。然而，外周循環中的甲胎蛋白易受機體其他疾病(如卵巢癌、急慢性肝炎、睪丸癌等)或生理狀態(如妊娠、肝病后肝臟細胞再生等)的影響，臨床上也存在大量全程無甲胎蛋白升高的肝細胞癌患者，從而降低了甲胎蛋白診斷肝細胞癌的準確度[16-17]。因此，臨床上也一直在尋找更為準確的無創生物學指標，以提高對肝細胞癌的診斷效能。CTC作為直接來源于肝細胞癌瘤體的脫落細胞，理論上，只要檢測方法足夠準確，檢測CTC等同于對腫瘤組織進行直接活檢，且CTC的檢測方法具有無創性和可重復性，是十分有價值的無創生物學標志物。

一項薈萃分析結果顯示，CTC計數用于診斷肝細胞癌的總體ROC曲線下面積可達0.93(95%CI：0.90～0.95)，且CTC陽性與無復發生存率及總體生存率存在相關性[18]。這提示CTC計數在肝細胞癌的臨床診斷方面具有良好的價值。Court等[19]基于NanoVelcro?CTC檢測平臺，使用脫唾液酸糖蛋白受體、聚糖蛋白-3及Ep-CAM作為腫瘤特異性表面標志物對富集CTC進行鑒定，結果顯示，在97%的肝細胞癌患者中檢出了CTC，CTC計數(當最佳截斷值為6個/mL時)用于鑒別診斷肝細胞癌患者與健康人的ROC曲線下面積可達0.92，其診斷靈敏度和特異度分別為0.842和0.885；此外，波形蛋白陽性的CTC(EpCAM+細胞的亞組)用于鑒別診斷早期與局部轉移患者的ROC曲線下面積可達0.89，診斷靈敏度及特異度分別為0.871及0.900。Chen等[20]使用了Canpatrol? CTC平臺對肝細胞癌患者的CTC進行檢測，結果顯示在95%的患者中檢出了CTC，CTC計數與腫瘤巴塞羅那分期、遠處轉移及血清甲胎蛋白水平具有相關性，CTC計數鑒別診斷肝細胞癌轉移與非轉移患者的ROC曲線下面積可達0.861(95%CI：0.782～0.940)。此外，該研究結果還顯示，在肝細胞癌患者中上皮性、混雜性和間充質性CTC的檢出率分別為53%、83%及57%，而手術后復發患者的混雜性和間充質性CTC比例更高，說明混雜性及間質性CTC是更具有侵襲性及遠處轉移能力的CTC表型。上述研究結果均提示，CTC在肝細胞癌的臨床診斷及預后評估具有良好的應用價值，這為針對肝細胞癌的無創診斷提供了重要參考。

3 CTC用于肝細胞癌的臨床預后評估

CTC作為從實體腫瘤脫離的細胞，仍具有腫瘤相關的生物學特性，包括增殖、侵襲及轉移能力，在外科手術切除或其他方法治療后，若仍能檢測出CTC，則提示患者存在復發的風險或已存在隱匿性的遠處轉移[21]。因此，CTC計數在評估肝細胞癌預后方面具有重要的參考價值，尤其是對于接受手術或其他輔助治療的患者，CTC計數可用于評估復發及遠處轉移風險。

3.1 CTC計數與患者臨床預后的關系 肝細胞癌患者的CTC計數與腫瘤分期、門靜脈癌栓形成及遠處轉移等臨床預后因素相關。Ogle等[22]使用了CK、EpCAM、甲胎蛋白、磷脂酰肌醇蛋白多糖3及DNA依賴性蛋白激酶作為特異標志物來檢測肝細胞癌患者的血液CTC計數，最終在65.2%的肝細胞癌患者中檢出了CTC，而健康對照組均未檢出CTC；同時發現肝細胞癌患者的CTC計數與腫瘤大小及門靜脈癌栓形成相關，CTC計數>1個/mL的患者中位生存時間僅為7.5個月，明顯低于CTC計數<1個/mL患者的34個月，CTC計數是影響患者遠期生存的獨立危險因素。Ou等[23]的研究結果顯示，70.9%的肝細胞癌患者CTC陽性(≥2個/5 mL)，CTC計數及間充質CTC(mesenchymal CTC，MCTC)與高甲胎蛋白水平、多發病灶、高TNM/巴塞羅那分期、存在腫瘤栓子相關；此外，MCTC計數還與肝細胞癌早期復發相關，可用于預測無短期復發生存率。Qi等[24]采用CanPatrol?CTC富集技術檢測了肝細胞癌患者的CTC計數，結果顯示， 90.18%的患者可檢出CTC(包含并無遠處轉移證據的早期肝細胞癌患者)，術前CTC計數≥16/mL及間充質樣CTC比例≥2%與早期復發、肝內多處復發及肺轉移相關；此項研究也同時發現，CTC陽性的慢性乙型肝炎病毒感染患者，在隨訪5個月內出現了早期肝細胞癌。上述研究結果均提示，早期CTC計數用于評估肝細胞癌患者的臨床預后具有重要價值。

3.2 CTC計數與手術后患者預后的關系 肝細胞癌患者接受外科手術或其他輔助治療后，CTC計數也可作為復發、轉移及遠期生存的參考指標。例如，Yu等[25]的研究結果顯示，肝細胞癌患者在手術切除肝細胞癌后，總體CTC計數反而較術前顯著升高，手術后CTC升高(≥2個/mL)的患者較低CTC(<2個/mL)患者的無病生存期及總生存期更短。Li等[26]發現，肝臟腫瘤患者(43例肝細胞癌及7例肝轉移腫瘤)行射頻消融術后3 d的CTC水平明顯升高，且CTC計數升高與肝細胞癌早期復發相關。分析上述研究結果的原因，可能是手術(消融)創傷直接導致部分腫瘤細胞從瘤體上脫落而形成了CTC，因此在手術切除腫瘤時應更為小心，避免對瘤體的物理擠壓及損傷。而Hao等[27]的研究結果則顯示，EpCAM+CTC≥3.5個/mL的肝細胞癌患者手術切除后的復發率更高于<3.5個/mL的患者，前入路肝切除的患者CTC計數較傳統入路肝切除患者更低、遠期預后更好。這從側面反映了肝細胞癌患者術后CTC計數升高的原因，即前入路肝細胞癌切除對瘤體的擠壓更少，從而避免了CTC形成。Zhou等[28]的研究結果顯示，手術前CTC及調節性T細胞計數較高的肝細胞癌患者發生術后復發的風險高于低計數水平患者，且EpCAM+CTC≥2.22/mL是患者術后1年內復發的獨立危險因素。還有研究顯示，特定亞型的CTC及EpCAM+的循環腫瘤干細胞用于預測手術后肝細胞癌的復發具有較高的臨床應用價值[29]。

4 小 結

CTC計數用于肝細胞癌的臨床診斷及預后評估具有重要的臨床價值。目前在肝細胞癌CTC檢測方面存在的問題主要有分選富集方法不夠高效，CTC的鑒定特異度有待提高，以及對實驗室及設備要求較高等。隨著CTC檢測技術的不斷完善以及臨床證據的積累，CTC必將在肝細胞癌的臨床診治中得到更廣泛的應用，從而使患者更大獲益。