肝纖維化動物模型造模方法的研究進展▲

呂艷杭 吳姍姍 王振常 葉學勁

(1 廣西中醫藥大學研究生學院，南寧市 530222，電子郵箱：2917138211@qq.com；2 廣西國際壯醫醫院脾胃肝病科，南寧市 530201)

【提要】 肝纖維化是由各種損肝因素作用于肝臟，導致肝內結締組織異常增生的病理過程，其主要病理特征是細胞外基質彌漫性沉積過多所致細胞外基質降解減少及肝竇毛細血管化，是各種慢性肝病向肝硬化甚至肝癌轉化的必經階段。成功制造出與各種致病因素相似的肝纖維化動物模型，可以為臨床深入研究肝纖維化發病機制及治療方法奠定基礎。本文將從肝纖維化動物模型造模的方法、效果、用途及優缺點等方面進行闡述。

肝纖維化是一種慢性肝病在修復過程中的病理狀態，其中慢性肝病包括慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、膽汁淤積性肝炎以及某些代謝性疾病等，其主要病理改變為肝內彌漫性細胞外基質的過度沉積。研究表明，肝纖維化作為所有慢性肝病的共同病理階段，是肝硬化甚至肝癌發展的必經階段[1-3]。大量研究證明，適當的治療措施可逆轉肝纖維化和早期肝硬化病理狀態，控制肝纖維化的發展對于肝硬化甚至肝癌的防治具有至關重要的作用[4-9]。因此，逆轉肝纖維化的治療成為眾多慢性肝臟疾病治療的匯聚點。而制造各致病因素動物模型是深入研究肝纖維化發病機制及治療藥物的前提基礎。本文將從肝纖維化動物模型造模的方法、效果、用途及優缺點等方面進行闡述，為今后研發治療肝纖維化的藥物提供臨床基礎研究。

1 化學藥物誘導的肝纖維化模型

1.1 四氯化碳誘導肝纖維化模型 四氯化碳法誘導肝纖維化模型是一種經典的造模方法，因其具有造模成功率高、方法簡便、費用低、時間短等優勢，成為臨床基礎研究中肝纖維化造模的首選方法。皮下注射濃度為40%～60%的四氯化碳聯合橄欖油是最常用的造模方法，每周注射2～3次，第8周時可成功制造肝纖維化模型[10]。四氯化碳法誘導肝纖維化模型的原理屬于氧化應激反應，機制是四氯化碳在肝臟內代謝生成三氯甲基自由基，產生的自由基誘發脂質過氧化反應，生成的過氧化物包括丙二醛和4-羥基壬烯酸，它們以線粒體為靶點，破壞線粒體膜結構，從而損傷肝細胞膜，激活肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)釋放Ⅰ型膠原酶和Ⅳ型膠原酶，促進HSC增生，導致肝纖維化。但四氯化碳毒性較大，大劑量使用可能導致實驗動物的大量死亡，而小劑量使用又容易導致造模失敗，為了提高造模的成功率，學者們對傳統的四氯化碳造模法不斷進行改良。目前常用的四氯化碳造模法主要包括腹腔注射、皮下注射及灌胃法。孫鵬等[9]通過改良四氯化碳注射濃度(40%)和注射時間(每3日1次，共14次)，采用四氯化碳大豆油溶液腹部皮下注射聯合高脂蛋白飼料喂養、60%食用酒灌胃，大大降低了實驗動物的死亡率，提高造模成功率。王永剛等[11]采用四氯化碳-橄欖油(含40%四氯化碳)3 mL/kg皮下注射(2次/周，共6周)，并以20%乙醇作為唯一飲用水灌胃造模，大大地提高了造模成功率，減少實驗動物的死亡率。楊鳳蕊等[12]采用3 mL/kg四氯化碳花生油溶液(含40%四氯化碳)聯合苯巴比妥經腹注射也提高了造模成功率。

1.2 二甲基亞硝胺誘導肝纖維化模型 二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)也叫亞硝基二甲胺，其分子式為C2H6N2O或(CH3)2NNO，具有巨大的肝毒性，對基因結構及免疫功能也具有一定的損傷作用，其主要作用機制是使核酸、蛋白質發生甲基化，大劑量使用易導致動物死亡，多次小劑量腹腔注射、灌胃及吸入可以導致肝細胞壞死，細胞外基質增多致使HSC被激活，細胞表型由上皮型轉化成間質型，促使HSC轉化成纖維細胞，導致肝臟退行性壞死，形成肝纖維化。DMN誘導肝纖維化模型的成模率高、周期短、死亡率低及可控性高。高雅等[13]給予大鼠1.6 mL/kg DMN溶液腹腔注射，3次/周，42 d時大鼠出現明顯的肝纖維化，即肝小葉消失、假小葉形成，與四氯化碳法相比大大縮短了建模的時間。王晶晶等[14]給予大鼠腹腔注射0.5% DMN生理鹽水稀釋液，劑量為2 mL/kg，1～3次/周，共注射28 d，停止使用DMN后肝纖維化不易自行吸收，提示病變穩定性強，DMN誘導的肝纖維化模型是研究抗纖維化藥物的理想模型。李偉偉等[15]也通過腹腔注射質量分數0.5% DMN溶液2 mL/kg，每2 d注射1次，連續4周，得到穩定的肝纖維化模型。

綜上所述，與四氯化碳法相比，DMN法具有周期短、方法簡單的優點，停止給藥后肝纖維化不易自行吸收恢復，但是DMN為致癌物質，其除了腹腔注射外，還可通過吸入(呼吸道、皮膚)等途徑產生毒性作用，因此實驗操作者在實驗時應格外小心謹慎。

1.3 硫代乙酰胺誘導肝纖維化模型 硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)分子式為CH3CSNH2，其誘導的急性肝損傷機制是TAA進入細胞內，被細胞色素氧化酶P450氧化后生成自由基，自由基與肝細胞膜脂質結合，誘發脂質過氧化破壞肝細胞膜，造成肝細胞的變性壞死。主要的造模方法有灌胃、腹腔注射、皮下注射等，最常用的是皮下注射。秦冬梅等[16]使用滅菌注射用水將TAA配制成質量濃度為40 mg/mL的溶液，對大鼠進行腹腔注射，3次/周，第8周時肝纖維化模型造模成功。薛改等[17]按160 mg/kg，對大鼠隔天灌胃濃度為3%的TAA，每周稱量體質量1次，嚴格按照體質量變化調整TAA的灌胃量，1周內體質量下降5%以內者維持原用量，1周內體質量下降5%～10%者用量減少為原用量的1/2，1周內體質量下降10%以上停止使用以避免死亡，結果顯示該方法可以降低大鼠的死亡率。張帥等[18]對大鼠皮下注射0.03%的TAA，劑量為200 mg/kg，2次/周，8周時肝纖維化模型造模成功。綜上所述，TAA造模時間較短，肝纖維化模型成功率高且相對穩定，死亡率低，可廣泛應用于臨床基礎研究。但其易揮發、毒性大、需要加強個人防護。

2 酒精誘導的肝纖維化模型

酒精分子式為C2H6O，進入人體內的酒精有90%在肝臟中代謝，其肝損傷機制是酒精進入肝臟細胞，在脫氫酶和微粒體乙醇氧化酶系的作用下轉化為乙醛，進而轉變為乙酸，促使還原性輔酶Ⅰ與反應性輔酶Ⅰ比值升高，抑制線粒體三羧酸循環，使肝內脂肪酸代謝發生障礙，氧化減弱，使中性脂肪堆積于肝細胞中，從而引起肝細胞的炎癥、變性、壞死，誘發膠原纖維堆積導致肝纖維化。目前主要通過31.5%酒精溶液(95%酒精與水混合制成)灌胃的方法制備酒精性肝纖維化模型[19]。有學者采用體積分數為50%的酒精誘導肝纖維化模型，16周時成功復制酒精性肝纖維化模型，證明此法操作簡單、經濟低廉[20]。李豐衣等[21]采用“白酒-吡唑-植物油”混合液灌胃法制備乙醇肝纖維化動物模型，即每天給予每只大鼠以4.8 g/kg白酒、24 mg/kg吡唑、2 mL/kg玉米油的混合液灌胃，灌胃量隨體重的變化進行調整，同時喂養高脂飼料(基礎飼料∶膽固醇∶豬油=79 ∶1 ∶20)，于16周時發現大鼠輕度酒精性肝纖維化形成，表明酒精復合因素灌胃可以成功制備肝纖維化模型，且成功率高、價格低廉、模型相對穩定。

3 非酒精性肝纖維化模型

非酒精性肝纖維化主要是指高脂肪、高蛋白及高膽固醇誘發的慢性非酒精性脂肪肝。隨著人們生活水平的不斷提高，慢性脂肪肝的患者不斷增加，所以高脂高膽固醇誘導的肝纖維化也是當前研究熱點。高脂高膽固醇所致肝纖維化的主要機制是：肝臟是脂肪代謝的重要場所，它可把血液中的脂肪酸合成為三酰甘油，三酰甘油與載脂蛋白結合為脂蛋白，并釋放入血液；長期攝入過多的動物脂肪、植物油和糖類等高熱量食物，過剩的營養物質在體內不能被充分利用，從而轉化為脂肪儲存起來，導致脂肪肝，肝臟的細胞“堆”滿了多余的脂肪，從而形成肝纖維化。楊銀花等[22]的研究表明，高脂飼料喂養Wistar大鼠能成功復制非酒精性脂肪肝，且價格低廉、成模率高、操作簡便，于喂養第8周時多數大鼠肝臟肝纖維化形成。綜上所述，高脂因素誘導的肝纖維化，造模周期短，操作方便，能復制出與人類相似的肝纖維化模型，可以很好地運用于人類非酒精性肝纖維化的研究。但喂養量尚未標準化，肝纖維化易自行吸收，模型相對不穩定。

4 膽管結扎性肝纖維化模型

膽管結扎性肝纖維化模型是通過人為結扎肝外膽管使其阻塞，形成肝纖維化。其結扎方法包括肝外膽管結扎法、膽管結扎后切斷法和逆行性注入 N-丁基-2-氰基丙烯酸鹽法三種方式。其主要機制是由膽管漸進性破壞、膽汁淤積及肝內炎癥持續存在，導致肝細胞及膽管細胞進一步損傷，發展為肝纖維化。慕永平等[23]采用膽總管結扎法制備膽汁淤積性肝纖維化大鼠模型，發現該模型可復制人類膽管梗阻造成肝纖維化的形態，且方法簡便，造模周期短，肝纖維化穩定可靠，無須與毒性物質接觸。

5 自身免疫性肝纖維化模型

自身免疫性肝纖維化的發病機制主要以遺傳因素為主，其他因素是在遺傳易感性基礎上，導致機體免疫耐受機制破壞，從而產生針對肝臟自身抗原的免疫反應，誘發肝臟炎癥壞死并進展為肝纖維化。實驗研究中主要以動物血清或者人血清蛋白作為抗原，將其注射入動物體內，復制肝纖維化動物模型。

5.1 動物血清誘發的肝纖維化模型 實驗室一般常選用豬血清、牛血清、馬血清或血吸蟲血清等給予實驗動物注射，引起膠原纖維堆積，導致肝小葉消失，形成假小葉，誘發肝纖維化。由于豬血清較牛血清價格便宜，而血吸蟲血清不易提取、價格昂貴，因此豬血清是實驗室肝纖維化造模的首選試劑。有學者采用豬血清(0.5 mL/次，2次/周，共12周)對大鼠進行腹部注射，在造模期間每周處死1只大鼠，觀察膠原纖維、肝纖維化指標及轉化生長因子β1，用來判斷大鼠成模情況，結果顯示，豬血清可成功誘導肝纖維化模型[24-27]。趙宏偉等[28]在傳統豬血清誘導肝纖維化(腹腔注射，0.5 mL/次，共12周)的基礎上進行改良，加用高脂高膽固醇飼料(80%玉米粉+20%豬大油+0.5%的膽固醇)飼養大鼠，結果發現實驗第4周時大鼠出現肝纖維化的現象，提示此法大大縮短了造模時間，方法簡便，價格低廉，模型相對穩定。

5.2 人血白蛋白誘發的肝纖維化模型 人血白蛋白所致的肝纖維化分為致敏和攻擊兩個階段。謝玉梅等[29]對人血白蛋白免疫攻擊法制備大鼠肝纖維化模型進行改良，使用生理鹽水稀釋人血白蛋白，與等量的不完全福氏佐乳劑乳化，予尾靜脈注射0.5 mL/次(含人血白蛋白4 mg)，共注射4次，前2次間隔14 d，后2次間隔10 d，并以30%乙醇為唯一飲用水，結果顯示蘇木精-伊紅染色、V-G膠原染色向肝小葉延伸，交織成網狀；進一步研究發現，在攻擊階段由尾靜脈注射改為腹腔注射，或者在注射人血白蛋白的基礎上加用四氯化碳，可增加造模成功率。

5.3 刀豆素蛋白誘發的肝纖維化模型 刀豆素蛋白誘導肝纖維化的機制是刺激T細胞有絲分裂，促進細胞因子(轉化生長因子β、腫瘤壞死因子α等)的釋放，引起炎癥反應，進一步使肝炎發展成肝纖維化。有學者將1 g/L刀豆素蛋白溶于滅菌的磷酸鹽緩沖溶液，按12.5 mg/kg給予每只大鼠進行尾靜脈注射，1次/周，第6次注射1周后處死大鼠，取肝組織分析，發現刀豆素蛋白誘導的大鼠肝纖維化與人類肝炎病毒肝纖維化接近，隨著刀豆素蛋白劑量的增加，肝損傷加重，此法操作簡單快捷[30-31]。

綜上所述，豬血清誘導肝纖維化模型是免疫性肝纖維化模型中最為經典的模型，其操作簡單、價格便宜、造模周期短，與化學藥物誘導的肝纖維化模型相比，穩定性更高，與臨床肝纖維化最為貼近，可以更好地服務于臨床基礎研究。

6 其他因素誘導的肝纖維化模型

除了上述的造模方法，還有血吸蟲感染實驗動物誘導肝纖維化、營養缺乏性大鼠肝纖維化模型、基因缺陷性大鼠肝纖維化模型及病毒誘導的肝纖維化模型[32-34]。

7 小 結

到目前為止，肝纖維化動物模型的造模方法越來越多，也越來越完善，這為研究肝纖維化提供了堅實的基礎。由于肝纖維化致病因素具有多樣性，而目前肝纖維化動物模型大多是單一因素造模(化學藥物、免疫肝損、酒精性肝損、高脂高膽固醇等)，無法用人類常見的肝炎病毒復制肝纖維化模型，仍然沒有找到與人類肝纖維化完全相似的模型，今后應從多方面尋找肝纖維化誘導方法，進一步探討肝纖維化的機制及治療方法。