動靜態小鼠胚胎培養方法的囊胚獲得率的對比▲

李 楠 張名媛 陽曉敏 林 忠

(1 廣西柳州市婦幼保健院生殖醫學中心/柳州市生殖與遺傳研究所/廣西科技大學附屬婦產醫院、兒童醫院，柳州市 545001,電子郵箱：linan520672@126.com；2 廣西醫科大學實驗動物中心，南寧市 530021；3 廣西壯族自治區生殖醫院婦產科，南寧市 530021)

人類輔助生育技術(assisted reproductive technology，ART)已成為治療各種原因導致不孕不育的主要手段，但是ART的臨床妊娠率僅約為30%，仍有很大的提高空間。移植高質量的胚胎是提高臨床妊娠率的關鍵，因此如何提高早期體外培養胚胎(第3天、第5天或第6天囊胚)的質量成為ART的重點研究課題之一。

目前，有關ART的研究都集中在優化培養液體上，如改進培養液的成分、補充能量、增加生長因子等。如何利用現在的培養液、氣體等條件，更加準確地模擬輸卵管內早期胚胎生長發育的環境，給胚胎一個更加接近或者相似的母體內培養環境，從而提高早期胚胎質量，是我們所面臨的主要問題。雖然相關技術不斷成熟，培養液(序貫培養液和階段培養液)、培養箱(單氣和三氣)等方面的優化仍未得到很好的改進，導致ART的妊娠率未能提高。在靜態微滴培養下，隨著胚胎代謝活動的逐漸增強，各類代謝產物、胚胎毒性物質不斷積累，而營養物質不斷被消耗，導致胚胎的發育能力受到阻礙[1]。有學者對早期胚胎在輸卵管內的發育過程及輸卵管內的生理表現進行研究，發現輸卵管內的纖毛細胞通過擺動引導胚胎向子宮移動，在這個過程中纖毛細胞還會產生6～20 Hz持續性的脈沖力，他們認為胚胎在體內的發育環境是動態的，是向子宮腔內移動的，其中早期胚胎周圍的化學環境和物理環境在不斷地發生變化[2]。本研究利用Viboviduct 1500胚胎微脈沖震動儀，模擬輸卵管內的動態環境，促進胚胎與培養液中物質的交換，觀察胚胎的體外發育情況，為提高早期體外培養胚胎的質量提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 20只昆明雌鼠，8～10周齡，體重40～45 g，10只昆明雄鼠，10～12周齡，體重50～55 g，動物及飼料、墊料均購自廣西醫科大學的實驗動物中心(動物許可證號SCXK桂2014-0002)。昆明鼠在12/12 h晝夜交替，濕度為45%～70%的25℃飼養環境中喂養，自主飲水和攝食，適應性飼養1周后按照程序進行超排卵。

1.2 主要藥品與試劑 人絕經期促性腺激素(human menopausal gonadotropin，HMG；批號：180908)、絨促性素(批號：180902)均購自麗珠藥業公司，均在有效期內使用。精子梯度分離液(批號：上層為99257190704，下層為99258190705)、人輸卵管液(human tubal fluid,HTF；批號：90126180603)操作液、血清蛋白替代品(批號：99193180302)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS；批號：9235171121)、胚胎培養礦物油(批號：507333)均購自美國Irvine公司。洗精液(批號：507573)、受精液(批號：507573)、卵裂培養液(G1，批號：507674)和囊胚培養液(G2，批號：507675)購自瑞典Vitrolife公司。

1.3 方法

1.3.1 超排卵干預：適應性喂養1周后，實驗第1天5：00 PM給雌性小鼠腹腔注射0.1 mL(10 U)HMG，48 h后，注射0.1 mL(10 U)絨促性素。

1.3.2 體外受精及胚胎培養：(1)卵母細胞的獲取。注射絨促性素14 h后，脫頸處死雌鼠，剖取輸卵管，用PBS洗滌后置于平皿內。無菌環境下，于解剖顯微鏡下用解剖針輕輕刺破輸卵管的膨大部，使卵母細胞自然流出，使用巴斯德管分離卵母細胞，將卵母細胞放入60 mm的4孔培養皿中。(2)精液的獲取。參照文獻[3]獲取精液，脫頸處死雄鼠，截取附睪尾，用PBS洗滌后置于平皿內。在無菌環境下，于解剖顯微鏡下用解剖針刺破附睪，釋放出精子，將精子挑到200 μL平衡過夜的受精液滴中，置于相應的培養箱(6.0%二氧化碳、37℃、100%濕度)中培養約1 h，精子獲能。(3)胚胎培養：將5～10 μL獲能的精子加入含有卵母細胞的60 mm 4孔培養皿中，置于培養箱(6.0%二氧化碳、37℃、100%濕度)中培養6 h后洗卵，將受精卵挑出放入含有卵裂液的培養皿中、置于培養箱(6.0%二氧化碳、37℃、100%濕度)再培養24 h，收集受精胚胎。將獲得的胚胎隨機分為靜態培養組和動態胚胎培養組。靜態培養組將胚胎分別放置于含卵裂培養液和囊胚培養液微滴的胚胎培養皿中，靜置于6%二氧化碳，100%濕度、37℃的培養箱培養114 h。動態胚胎培養組則將胚胎培養皿放置于Viboviduct 1500胚胎微脈沖震動儀(德國SimSoTec公司)上，Viboviduct 1500的設置參數為42 Hz,6 s/60 min，其他操作與靜態培養組相同，實驗所用的液體均需要過夜平衡處理，胚胎培養及受精所用液體均在6.0%二氧化碳、37℃、100%濕度環境中過夜平衡處理。

1.4 觀察指標 將獲得的胚胎置于培養箱中，以完成絨促性素注射后計算時間，經72 h和114 h分別得到8細胞期的胚胎和囊胚，記錄靜態培養及動態培養的卵裂胚胎數和囊胚數。

1.5 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計數資料以例數(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

共110個胚胎行靜態培養，卵裂胚胎數102個，囊胚數89個，囊胚率為80.9%；共120個胚胎行動態培養，卵裂胚胎數113個，囊胚數111個，囊胚率為92.5%。動態培養的囊胚率高于靜態培養(χ2=6.798,P=0.009)。

3 討 論

培養出高質量的胚胎，是行體外受精-胚胎移植后獲得妊娠的主要因素之一。雖然體外胚胎培養技術已取得很大的進步，但目前所使用的靜止微滴培養系統仍無法完全模擬哺乳動物雌性生殖道的生理及環境條件[4]。靜態培養系統所獲胚胎與體內生長發育的胚胎相比仍存在較多缺點，如有較高的染色體倍型異常率，RNA活性存在差異，大量輔助因子的基因出現異常表達，冷凍保存后解凍復蘇效果較差等，導致移植后獲得的胚胎存在較多問題。研究顯示，體內的胚胎在發育過程中處于一個動態的環境：著床前的胚胎是獨立的，在輸卵管內自由浮動，借助液體的流動不斷移動到達子宮并植入子宮[5]。但培養箱內的環境則是靜態的。

為解決靜態培養所面臨的問題，有學者提出了動態培養，認為其可以更好地模擬女性輸卵管內的生理環境和體內動態環境，促進胚胎發育和提高胚胎質量[6]。德國SimsoTec公司推出了Viboviduct 1500微脈沖震蕩儀，該產品可模仿女性輸卵管的振動[7]，通過設置振動的強度、頻率和時間間隔，模擬輸卵管對胚胎的刺激從而提高胚胎體外培養的質量[8]。其還可以避免流體剪切力對細胞的損害，消除代謝物蓄積對胚胎生長發育的不利影響，有效模擬輸卵管的內部微環境，激活營養信號通路等，從而促進胚胎發育和提高胚胎質量[9]。Heo等[10]研究微流控的動態胚胎培養對小鼠胚胎發育的影響，發現動態胚胎培養的孵化囊胚數和內細胞團數均多于靜置培養體系，且與體內來源的囊胚相似。這提示動態胚胎培養法不僅有利于小鼠植入前胚胎發育，而且提高了胚胎的種植率和繼續妊娠率，有效降低了流產率。Hur 等[11]認為，動態培養可以顯著提高優胚率及囊胚細胞數，以及D5的囊胚率和臨床妊娠率。Isachenko等[12]的研究結果顯示，脈沖振動可以顯著提高胚胎的發育能力和臨床妊娠率。此外有研究顯示，使用動態培養可以促進鈣離子的流通，不會影響胚胎的自分泌生長因子，可提高優胚率和囊胚率[13]。本研究結果顯示，與靜態培養相比，動態培養可以提高囊胚率。這提示基于Viboviduct 1500微脈沖震蕩儀的胚胎動態培養方法，可通過設置微動力的頻率和時間來調整培養液，同時模擬體內胚胎輸卵管的機械和生化環境，從而提高胚胎的發育潛能。

綜上所述，基于Viboviduct 1500微脈沖震蕩儀的胚胎動態培養方法，可以提高胚胎的發育潛能，提高囊胚率。但本研究尚處于初級階段，還需要大量的臨床試驗數據來證實其應用于人類胚胎培養的可行性。