基于5-hmC的液體活檢在早期肝細胞癌診斷中的應用價值

鄭立威 李德瑤 魯鳳民 陳香梅

原發性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，居癌癥相關死亡原因的第二位，近年來發病率持續增長，嚴重威脅我國人民的生命健康[1]。肝細胞癌(HCC)是原發性肝癌的主要病理類型，占原發性肝癌的85%～90%[1]。HCC的早期發現、診斷及治療是改善患者生存預后的關鍵。我國85%以上的HCC與慢性HBV感染有關，因此在慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化(LC)患者中進行HCC篩查和監測是實現HCC早診斷的最有效途徑[1-2]。

目前臨床上用于HCC檢測和診斷的血液學指標主要有血清甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白異質體(AFP-L3)、異常凝血酶原(DCP)等，其中AFP為肝癌診斷和療效監測中最常用且重要的標志物[1-3]。研究表明，AFP在HBV感染相關HCC的診斷、預后評估方面都有一定價值[3-4]。但由于HCC隱匿性高，血清AFP診斷早期HCC的能力十分有限，經此確診的大部分患者已處于疾病進展期，并且在非HBV相關HCC患者中，AFP診斷HCC的靈敏度和特異度較低[4]。因此，當前亟需開發能夠診斷早期HCC的無創性標志物，以對HCC進行更早的干預和治療。

一、關于5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)

近年來，血漿中細胞游離DNA(cfDNA)在腫瘤診斷中的應用受到越來越多的關注。cfDNA中含有由腫瘤細胞凋亡或壞死而釋放至外周血的DNA，因此cfDNA不僅含有與原發腫瘤細胞相同的體細胞突變類型，而且還具有相同的表觀遺傳模式[5]。其中，cfDNA的甲基化是目前研究最廣泛的一類表觀遺傳學特征，尤其是CpG島上的5-mC修飾。已有多項研究表明，cfDNA的甲基化檢測可作為包括HCC在內的多種腫瘤的診斷及預后指標[6]。DNA去甲基化也是真核細胞表達調控的一種重要模式。在DNA去甲基化過程的第一步，5-mC在TET蛋白的作用下被氧化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)[7]。5-hmC不僅是DNA主動去甲基化過程的中間產物，也是一種穩定存在的表觀遺傳標記[8]。相較于5-mC修飾的沉默效應，5-hmC修飾可以引起基因的激活表達，因此這一類表觀遺傳學修飾模式具有更高的疾病特異性，且能動態、靈敏地反映疾病狀態下基因的表達水平。而近年來的研究發現，5-hmC在多種腫瘤中缺失，提示cfDNA的5-hmC檢測在腫瘤篩查、診斷及預后預測中具有潛在應用價值，也為HCC的診斷帶來了新的可能[9]。

二、5-hmC的檢測方法

目前已建立的5-hmC檢測方法包括UHPLC-MS/MS、hMe-Seal、5-hmC-Seal等[10-12]。其中5-hmC-Seal是在hMe-Seal技術基礎上優化而成的全基因組5-hmC檢測方法，可以在1～10 ng cfDNA中對5-hmC進行基因圖譜的繪制，是目前最先進的5-hmC檢測技術[12]。

5-hmC-Seal技術利用β-葡糖基轉移酶選擇性地將一個化學修飾過的葡糖基(6-N3-glucose)轉移到5-hmC的羥基上，然后向疊氮基團標記的5-hmC中加入生物素，通過磁珠對5-hmC修飾的DNA片段進行富集，結合高通量測序技術分析5-hmC在基因組上的分布情況[12]。應用5-hmC-Seal方法，已在結直腸癌、胃癌、食道癌、肺癌、肝癌等多種腫瘤患者血漿cfDNA中檢測、分析5-hmC修飾水平，結果顯示血漿cfDNA的 5-hmC檢測可用于輔助癌癥診斷[13]。

三、5-hmC在HCC診斷中的應用

近期，Cai等[11]通過一項包括1 204例HCC患者、392例CHB或LC患者及958例健康對照的隊列研究，建立了一個基于受試者血漿cfDNA 5-hmC修飾的HCC診斷模型。該研究將受試者分為訓練集與驗證集，通過對訓練集結果的分析篩選出了917個在HCC與CHB/LC患者中 5-hmC水平存在差異的候選基因。進而通過彈性網絡正則化方法及邏輯回歸模型從中篩選出了由32個在HCC患者cfDNA中5-hmC水平顯著升高的基因組成的5-hmC標志物組合(5-hmC marker panel)，并最終建立了一個用于HCC診斷的加權評分(wd-score)診斷模型[11]。

盡管wd-score模型對晚期HCC的診斷效能與AFP相當，但在區分早期HCC患者與健康對照、早期HCC患者與CHB/LC患者方面，該模型的診斷效能顯著優于AFP。值得注意的是，聯合AFP與wd-score模型能夠進一步提高診斷效能(AUC提高約1%)[11]。此外，早期HCC患者wd-score評分隨HCC分期進展而升高。除分期外，wd-score還能預測腫瘤大小[11]，提示該模型或可作為HCC治療過程中療效的監測指標。將wd-score評分用于原發性胰腺導管腺癌(PDAC)患者發現，該模型可較好區分HCC及PDAC[11]，表明對HCC診斷具有特異性。

四、5-hmC與HCC相關性的潛在機制

多項研究表明，5-hmC修飾在外顯子、增強子區域富集[11, 13-15]，表明該修飾與基因表達激活相關。而腫瘤患者中5-hmC水平的異常[11, 13, 15]，則提示了5-hmC修飾在腫瘤發生、發展中的潛在作用。因此，探索5-hmC在腫瘤發病機制中的作用不僅有助于闡明5-hmc作為腫瘤標志物的潛在機制，亦有利于腫瘤治療新靶點的開發。Cai等[11]對917個在HCC與CHB/LC中 5-hmC水平存在差異的候選基因進行KEGG富集分析發現，這些5-hmC水平異常的基因主要富集在各種代謝過程通路中，如“甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝”等，且其中相當一部分基因與HBV感染、肝纖維化和HCC的發病機制有關[11]， 提示5-hmC可能參與了HBV感染相關的肝臟疾病的發生和發展。通過TCGA數據庫分析發現，HCC患者cfDNA中5-hmC修飾水平最高的幾種基因在HCC中表達上調[11]，提示5-hmC修飾與基因表達調控相關，且這種表達調控功能可能通過H3K4me1和H3K27ac組蛋白修飾介導[11, 14]。

五、5-hmC作為HCC診斷的血清學標志目前仍需解決的問題

作為一種新型腫瘤標志物，已有多項研究報道了5-hmC在肺癌、結直腸癌、胃癌、肝癌等腫瘤組織及cfDNA中的異常表達狀態[11, 13-15]。與HCC、膠質母細胞瘤等腫瘤不同，肺癌患者cfDNA的5-hmC水平低于健康對照，且隨肺癌分期進展逐漸下降[13]，提示5-hmC水平的變化在不同腫瘤中意義不同。在結直腸癌及胃癌中，可以分別通過檢測不同的特異性5-hmC修飾差異位點來區分患者與健康對照[15]，這說明5-hmC的診斷panel具有疾病特異性。盡管不同腫瘤背景下5-hmC富集的基因座的差異決定了Cai等[11]開發的wd-score診斷模型對HCC具有特異性，但此模型僅在HCC和小樣本的PDAC患者中進行了臨床診斷效果驗證，其HCC特異性尚需在胃癌、肺癌等其他常見腫瘤中進行進一步的驗證。

LC患者是發生HCC的高危人群，其HCC年發生率約為1%～8%，且隨著年齡的增加，HCC的發病率也不斷增長。從成本效益分析來看，在肝硬化人群中進行早期HCC的篩查監測效果更佳[1-2]。Cai等在研究中未區分LC及CHB受試者，wd-score在單獨鑒別診斷LC與HCC患者時的診斷效能仍需在更大樣本量的臨床研究中得到證實。由于HCC患者基礎病史不同，在慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、酒精性及非酒精性脂肪肝等不同慢性肝病發展形成的HCC患者中，5-hmC修飾水平是否存在差異也需進一步結合臨床數據進行分析探究。

此外，值得注意的是，由于cfDNA組成成分復雜，僅有一部分cfDNA來源于腫瘤細胞，因此cfDNA中檢測到的突變(如KRAS、TP53突變)可能來自于cfDNA中的非腫瘤細胞部分，如造血細胞等[16]。而cfDNA表觀遺傳學改變與腫瘤細胞基因組改變的關系目前還尚不清楚，但研究結果顯示cfDNA的5-hmC修飾水平的變化可能與腫瘤細胞并不一致[9-11, 15]，因此cfDNA診斷假陽性的問題仍值得關注。結合cfDNA上的腫瘤特異性突變(如EGFR、BRAF等)[16]或特定區域表觀遺傳修飾改變，將有助于這一問題的解決。

綜上所述，盡管大規模推廣5-hmC作為HCC的液體活檢仍存在諸多問題，5-hmC檢測因其操作無創性、組織特異性好、腫瘤特異性高，并且在HCC早期診斷時靈敏度和特異度均優于血清AFP這一系列優點，有望在不久的將來應用于臨床肝癌診斷。但若想將cfDNA中的5-hmC修飾作為新型腫瘤標志物進行推廣，目前的5-hmC檢測方法即5-hmC-Seal仍需要進一步簡化和標準化，以增加檢測的準確性和可重復性，并降低成本。