耐藥結(jié)節(jié)細(xì)胞分化超家族介導(dǎo)鮑曼不動(dòng)桿菌替加環(huán)素耐藥機(jī)制研究

張心宇， 杜雪飛， 鄒桂玲， 姜曉峰

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 哈爾濱 150001）

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種常見的可引起醫(yī)院感染的條件致病菌，隨著抗菌藥物的廣泛使用，越來越多的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌（multidrugresistant Acinetobacter baumannii，MDR-AB）被發(fā)現(xiàn)[1-3]。替加環(huán)素是目前治療MDR-AB和碳青霉稀類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的少數(shù)可選藥物之一。目前，我國已有替加環(huán)素不敏感或耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的相關(guān)報(bào)道[1-3]，但鮑曼不動(dòng)桿菌對替加環(huán)素的耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，至今尚未被完全闡明。有研究結(jié)果顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌對替加環(huán)素的耐藥機(jī)制與耐藥結(jié)節(jié)細(xì)胞分化超家族（resistance nodulation division，RND）外排泵高表達(dá)有關(guān)[4-8]，但這一結(jié)論并不適用于所有菌株[5-6，9-10]，目前關(guān)于鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥的研究多集中于我國南方地區(qū)，東北地區(qū)目前尚無相關(guān)報(bào)道。本研究旨在了解哈爾濱地區(qū)RND外排泵介導(dǎo)MDR-AB替加環(huán)素敏感性降低的相關(guān)機(jī)制，探討鮑曼不動(dòng)桿菌替加環(huán)素耐藥與RND外排泵基因表達(dá)的關(guān)系，進(jìn)一步明確鮑曼不動(dòng)桿菌對替加環(huán)素耐藥的可能機(jī)制，以指導(dǎo)臨床合理用藥。

1 材料和方法

1.1 菌株篩選

收集2015年11月—2018年2月分離自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院患者的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）≥4 μg/mL的鮑曼不動(dòng)桿菌21株。同時(shí)隨機(jī)選取同一時(shí)期替加環(huán)素MIC≤2 μg/mL的MDRAB 39株。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、大腸埃希菌（ATCC 25922）和鮑曼不動(dòng)桿菌（ATCC 19606），均購自國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 儀器與試劑

VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀（法國生物梅里埃公司），基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（德國布魯克公司），TC-96/G/H（b）bioer基因擴(kuò)增儀（杭州博日公司），LightCycler480Ⅱ高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司），BIORAD通用基礎(chǔ)電泳儀（美國伯樂公司），Ultra PowerTM可見光透射儀（北京百泰克公司）。替加環(huán)素藥物敏感性試驗(yàn)試劑（溫州生物公司），哥倫比亞瓊脂、MH瓊脂（鄭州安圖生物工程股份有限公司），Taq PCR Master Mix（2×with Blue Dye）、DNA Marker D（100～2 000 bp）、LB Broth-ready to us、Trizol試劑、RNA-E2 Reagents N DNA-Be-GoneA、M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒[生工生物工程（上海）有限公司]，Biowest Agarose（西班牙Biowest公司），AceQ qPCR SYBR Green Mastermix（南京Vazyme公司）。根據(jù)文獻(xiàn)[16-18]確定引物序列，由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列見表 1。

1.3 體外藥物敏感性試驗(yàn)

采用VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀檢測β內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、碳青霉烯類、四環(huán)素類、喹諾酮類、磺胺類抗菌藥物及替加環(huán)素的MIC。對替加環(huán)素MIC≥4 μg/mL的菌株分別采用紙片擴(kuò)散法及微量肉湯稀釋法檢測其對替加環(huán)素的敏感性。紙片擴(kuò)散法、微量肉湯稀釋法替加環(huán)素敏感性折點(diǎn)參考2014年歐洲藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）標(biāo)準(zhǔn)，其他抗菌藥物敏感性折點(diǎn)參照2017年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100-S27文件。以微量肉湯稀釋法為標(biāo)準(zhǔn)方法，以替加環(huán)素非敏感菌株（MIC≥2 μg/mL）為實(shí)驗(yàn)組，替加環(huán)素敏感菌株（MIC≤1 μg/mL）為對照組。

1.4 RND外排泵基因檢測

采用煮沸法提取菌株的模版DNA，檢測adeB、adeG、adeJ、adeS、baeR和baeS基因。反應(yīng)體系：Taq PCR Master Mix（2×with Blue Dye）10 μL，上、下游引物各5 μmol/L，模版DNA濃度為40～100 ng，雙蒸水補(bǔ)充體系至20 μL。反應(yīng)條件： 預(yù)變性 95 ℃ 10 min；變性95 ℃ 1 min，退火52 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠中電泳30 min，觀察結(jié)果。

表1 RND外排泵操縱子及內(nèi)參基因引物序列

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RTqPCR）檢測外排泵表達(dá)量

采用Trizol法提取鮑曼不動(dòng)桿菌（ATCC 19606）標(biāo)準(zhǔn)菌株及對照組、實(shí)驗(yàn)組菌株對數(shù)生長期細(xì)菌總RNA。每10 μL反轉(zhuǎn)錄體系利用1 g總RNA合成第1鏈cDNA，反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min。采用RT-qPCR檢測外排泵adeB、adeG、adeJ、adeR、baeR和baeS轉(zhuǎn)錄水平，采用LightCycler480Ⅱ高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀配套軟件分析得到各個(gè)樣本管家基因gyrB和Ct值，以管家基因gyrB為內(nèi)參，MDR-AB標(biāo)準(zhǔn)菌株鮑曼不動(dòng)桿菌（ATCC 19606）為參考菌株，采用2-ΔΔCT法計(jì)算各外排泵基因的相對表達(dá)量。

1.6 雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)基因插入序列檢測

對于外排泵基因adeB表達(dá)水平升高的菌株，采用PCR對其adeS基因進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序，通過ISFinder數(shù)據(jù)庫比對查找插入序列。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

采用VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀共鑒定出替加環(huán)素非敏感鮑曼不動(dòng)桿菌21株，采用紙片擴(kuò)散法抗菌藥物敏感性試驗(yàn)篩選出替加環(huán)素抑菌圈直徑≤12 mm的菌株10株，采用微量肉湯稀釋法篩選出替加環(huán)素MIC≥2 μg/mL的菌株12株，并且這些菌株對亞胺培南亦耐藥。VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀分析的MIC值與微量肉湯稀釋法相比，高2～4個(gè)稀釋度。實(shí)驗(yàn)組鮑曼不動(dòng)桿菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.2 RND外排泵基因檢測結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組、對照組所有菌株均檢出RND相關(guān)外排泵基因adeB、adeG、adeJ、adeS、baeR和baeS，檢出率為100%。

2.3 RND外排泵轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量檢測結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組adeB表達(dá)水平在不同菌株之間存在差異，替加環(huán)素非敏感菌株TR5、TR13和TR20 adeB的表達(dá)水平分別約是替加環(huán)素參考菌株鮑曼不動(dòng)桿菌（ATCC 19606）的3.3、3.5和2.7倍。adeG相對表達(dá)水平在菌株TR7中稍有升高，約是參考菌株鮑曼不動(dòng)桿菌（ATCC 19606）的2.8倍。adeJ、adeR、baeR以及baeS表達(dá)水平在菌株中未見明顯升高。見圖1。

12株替加環(huán)素非敏感菌株adeB、adeG、adeJ、adeR、baeR及baeS的相對表達(dá)量分別為1.43±0.32、1.107±0.20、0.86±0.10、0.84±0.14、0.13±0.03和1.12±0.10；48株替加環(huán)素敏感菌株adeB、adeG、adeJ、adeR、baeR及baeS的相對表達(dá)量分別為1.12±0.12、0.48±0.06、0.66±0.06、 0.66±0.09、0.10±0.01和1.53±1.11。見圖2。

表2 實(shí)驗(yàn)組鮑曼不動(dòng)桿菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

圖1 實(shí)驗(yàn)組RND外排泵相對表達(dá)量

2.4 adeS突變檢測

外排泵表達(dá)水平增高與上游雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)adeS序列插入有關(guān)，在外排泵高表達(dá)替加環(huán)素非敏感菌株TR5及TR13的adeS基因中發(fā)現(xiàn)了ISAbaⅠ插入序列。在菌株TR5中發(fā)現(xiàn)的ISAbaⅠ插入序列。部分測序結(jié)果見圖3。

圖2 實(shí)驗(yàn)組及對照組RND外排泵相對表達(dá)量

圖3 TR5菌株adeS基因插入序列ISAbal部分測序結(jié)果

3 討論

替加環(huán)素是目前治療MDR-AB和碳青霉稀類抗菌藥物耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的少數(shù)可選藥物之一，抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、不良反應(yīng)小，且應(yīng)用不受患者年齡、性別、病情等的限制。自2005年美國食品藥品監(jiān)督管理局（U. S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)替加環(huán)素應(yīng)用于臨床治療后，僅1年就分離到了替加環(huán)素敏感性降低的鮑曼不動(dòng)桿菌。目前，我國也檢出了替加環(huán)素不敏感或耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌，然而替加環(huán)素的耐藥機(jī)制仍不明確。

目前，臨床實(shí)驗(yàn)室多以VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌對替加環(huán)素的敏感性，但在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)胞鑒定儀的鑒定結(jié)果較微量肉湯稀釋法MIC值高2～4個(gè)稀釋度，“假中介”及“假耐藥率”較高，因此VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)胞鑒定儀能否作為鮑曼不動(dòng)桿菌替加環(huán)素敏感性檢測的方法仍有待商榷。臨床上檢測替加環(huán)素抑菌活性的方法很多，培養(yǎng)基配制時(shí)間、錳的含量、易氧化等因素往往會(huì)使結(jié)果的準(zhǔn)確性受到影響[14]。《替加環(huán)素體外藥敏試驗(yàn)操作規(guī)程專家共識》推薦以肉湯稀釋法作為金標(biāo)準(zhǔn)，建議當(dāng)VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀確定鮑曼不動(dòng)桿菌替加環(huán)素中介或耐藥時(shí)，應(yīng)用微量肉湯稀釋法進(jìn)行確證[15]。

作為RND的3種外排泵，AdeABC，AdeFGH和AdeIJK與該物種的替加環(huán)素耐藥性有關(guān)，由膜融合蛋白（membrane fusion protein，MFP）、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和外膜因子（outer membrane protein，OMF）3種蛋白質(zhì)共同發(fā)揮作用。雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)AdeRS與BaeRS位于AdeABC上游，可感應(yīng)外界環(huán)境并在保守組氨酸殘基發(fā)生自磷酸化，通過轉(zhuǎn)移磷酸基團(tuán)并調(diào)控DNA 的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)[16]。本研究結(jié)果顯示，adeB、adeG、adeJ、adeS和baeRS基因在所有的實(shí)驗(yàn)組和對照組菌株中都被檢測到，驗(yàn)證了外排泵基因很可能是鮑曼不動(dòng)桿菌的固有基因這一觀點(diǎn)，即當(dāng)菌株暴露在外排泵底物環(huán)境中時(shí)，外排泵基因表達(dá)水平會(huì)上調(diào)，從而使菌株耐藥[17]。

通過RT-qPCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組菌株TR5、TR13和TR20的adeB表達(dá)水平上調(diào)。同時(shí)在TR5和TR13的adeS中發(fā)現(xiàn)ISAbaⅠ序列插入，已知機(jī)制表明ISAbaⅠ插入adeS會(huì)產(chǎn)生1個(gè)N末端截短的adeS和由ISAba1 Pout啟動(dòng)子產(chǎn)生的mRNA轉(zhuǎn)錄本。這種截短的adeS能夠激活adeR，并增強(qiáng)adeABC基因表達(dá)[18]。SUN等[18]和HAMMERSTROM等[19]的研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致。除AdeRS以外，雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)BaeRS可正向調(diào)控adeB的表達(dá)[12，20]，TR20中僅adeB表達(dá)量增加，該結(jié)果的出現(xiàn)不排除RND外排泵僅作為鮑曼不動(dòng)桿菌替加環(huán)素敏感性降低的輔助因素。目前認(rèn)為低劑量抗菌藥物治療會(huì)使AdeFGH外排泵過度表達(dá)，增加誘導(dǎo)生物膜形成的自誘導(dǎo)分子的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)[21-23]；另外，某些藥物，如去甲腎上腺素也會(huì)導(dǎo)致AdeFGH的過表達(dá)，誘導(dǎo)生物膜形成[8]。由于本研究未進(jìn)行多位點(diǎn)序列分子分型研究，所以無法說明去甲腎上腺素具體如何誘導(dǎo)adeG表達(dá)水平升高以及是否存在其他非抗菌藥物類藥物影響鮑曼不動(dòng)桿菌的抗菌活性，這也是我們下一步研究的重點(diǎn)。

值得注意的是，雖然本研究中外排泵基因的檢出率為100%，但僅有少數(shù)菌株的外排泵基因水平表達(dá)上調(diào)，且表達(dá)水平上調(diào)的幅度并不高。這一結(jié)果表明，RND外排泵基因高表達(dá)很可能不是鮑曼不動(dòng)桿菌替加環(huán)素敏感性下降的唯一因素。有研究發(fā)現(xiàn)，外排泵在細(xì)菌耐藥過程中主要介導(dǎo)低水平耐藥，只作為一種耐藥背景參與替加環(huán)素耐藥的發(fā)生[17]。因此，我們推測RND外排泵可能僅輔助其他耐藥機(jī)制促進(jìn)替加環(huán)素耐藥發(fā)生，而這一假設(shè)還有待進(jìn)一步研究確證。