北京地區(qū)晚發(fā)性阿爾茲海默病患者apo E基因多態(tài)性與血脂的相關性

洪 萍， 王培昌

（首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院檢驗科，北京 100053）

阿爾茲海默病（Alzheimer's disease，AD）是老年癡呆最常見的類型，具有老年斑、神經(jīng)纖維纏結、海馬及皮層神經(jīng)元缺失的病理特征，臨床上表現(xiàn)為進行性、不可逆性的記憶和認知功能減退。近年來，隨著人類平均壽命的延長，AD的發(fā)病率也隨之增高，已經(jīng)成為威脅人類健康的重大公共問題[1]。AD被分為以孟德爾疾病方式遺傳的家族性AD及無明顯家族聚集發(fā)作的散發(fā)性AD。95%以上的AD屬于散發(fā)性AD，好發(fā)于65歲以上的老年人，由于發(fā)病較晚，散發(fā)性AD也被稱為晚發(fā)性阿爾茲海默病（late-onset Alzheimer's disease，LOAD）[2]。目前，家族性AD的發(fā)病機制已被證實是由300余個基因突變導致，而LOAD的發(fā)病機制仍不明確，可能是由環(huán)境和基因共同作用導致的。載脂蛋白E（apolipoprotein E，apo E）基因是目前唯一被公認的與LOAD相關的基因。由于apo E是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的載脂蛋白，在膽固醇動員、重新分布及排泄等代謝過程中均具有重要作用，因此脂質(zhì)代謝可能參與了LOAD的發(fā)病過程。有研究結果顯示，膽固醇紊亂在LOAD的發(fā)病過程中具有重要作用[3]。目前，我國關于LOAD患者apo E基因多態(tài)性及其與血清脂質(zhì)水平之間關系的研究較少。為此，本研究擬探討北京地區(qū)LOAD患者apo E基因多態(tài)性及與脂質(zhì)譜的相關性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年1月—2018年1月首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科癡呆門診確診的AD患者150例（AD組），其中男79例、女71例，年齡（77.92±10.93）歲，均符合2011年美國國立衰老研究院和阿爾茲海默病協(xié)會（the National Institute on Aging，NIA）的AD診斷標準[1]以及美國國立神經(jīng)病、語言交流障礙和卒中研究所-老年性癡呆及相關疾病學會（the National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke-the Alzheimer's Disease and Related Diseases Association，NINCDSADRDA）的AD診斷標準[4]。另選取同期首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院體檢健康者150名（正常對照組），其中男76名、女74名，年齡（77.28±10.79）歲。所有研究對象均排除嚴重肝、腎疾病及嚴重感染、惡性腫瘤。2個組之間年齡和性別差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采用乙二胺四乙酸二鉀（ethylenediaminetetraacetic acid-K2，EDTA-K2）抗凝管和促凝膠真空采血管分別采集AD患者未服用降脂藥物前的空腹靜脈血和正常對照者體檢當日的空腹靜脈血。EDTA-K2抗凝全血用于apo E基因分型，促凝膠真空采血管用于檢測血脂水平。

1.2.2 血脂檢測 采用7600全自動生化分析儀（日本日立公司）及配套試劑檢測血脂，項目包括總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和小而密低密度脂蛋白膽固醇（small and dense low-density lipoprotein cholesterol，sd-LDL-C）、載脂蛋白A（apolipoprotein A，apo A）、載脂蛋白B（apolipoprotein B，apo B）及脂蛋白（a）[lipoprotein （a），Lp（a）]。

1.2.3 apo E基因分型 采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增特定的基因片段，并與基因芯片上的特異性核酸探針雜交。通過檢測apo E基因112和158位點的6個型別（E2/2、E2/3、E2/4、E3/3、E3/4和E4/4）進行分型。apo E基因型檢測試劑盒（基因芯片法）購自珠海賽樂奇生物科技有限公司。PCR雜交判讀標準：基因芯片上相應位點的信號灰度值與背景灰度值的差≥4，判定為陽性；反之判定為陰性。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。等位基因頻率用基因頻率計數(shù)法計算，Hardy-Weinberg（H-W）平衡采用擬合優(yōu)度χ2檢驗。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以s表示，2個組之間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用多因素非條件Logistic回歸分析篩選LOAD的相關危險因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 apo E基因型頻率及等位基因頻率分布

H-W平衡檢驗結果顯示，AD組apo E基因中E3/4基因型和ε4等位基因頻率最高，正常對照組E3/3基因型和ε3等位基因頻率最高。AD組E2/3和E3/3基因型頻率均低于正常對照組（P＜0.05），E3/4和E2/4基因型頻率均高于正常對照組（P＜0.01）。AD組ε3等位基因頻率低于正常對照組（P＜0.05），ε4等位基因頻率高于正常對照組（P＜0.01）。見表1。

2.2 AD組與正常對照組血脂水平的比較

與正常對照組比較，AD組TC、LDL-C和sd-LDL-C水平明顯升高（P＜0.01），HDL-C水平明顯降低（P＜0.01）。其他項目2個組之間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表1 AD組和正常對照組apo E基因型及等位基因頻率比較 例（%）

表2 AD組和正常對照組血脂水平比較

Lp（a）/（mg/L）AD組 150 4.53±0.85 1.35±0.13 3.57±0.33 1.13±0.11 1.14±0.11 1.27±0.161.05±0.11282.63±199.47正常對照組 150 3.76±0.87 1.32±0.15 2.38±0.19 0.78±0.05 1.62±0.27 1.35±0.150.98±0.08255.41±183.34 t值 4.57 -0.04 4.63 4.51 -4.09 -0.04 0.46 0.23 P值 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05組別 例數(shù) TC/（mmol/L）TG/（mmol/L）LDL-C/（mmol/L）sd-LDL-C/（mmol/L）HDL-C/（mmol/L）apo A/（g/L）apo B/（g/L）

2.3 AD組不同apo E表型患者血脂水平的比較

TC及LDL-C水平在AD組ε2、ε3和ε4表型患者中依次升高（P＜0.05），其他血脂項目3種表型之間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 AD組不同apo E表型患者血脂水平比較 x±s

2.4 正常對照組不同apo E表型血脂水平的比較

正常對照組ε4表型LDL-C水平明顯高于ε2表型（P＜0.05），其他血脂項目3種表型之間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 正常對照組不同apo E表型者血脂水平比較

表4 正常對照組不同apo E表型者血脂水平比較

注：與ε2表型比較，*P＜0.05

apo E表型 例數(shù) TC/（mmol/L）Lp（a）/（mg/L）ε2 34 3.81±0.82 1.22±0.12 2.22±0.18 0.79±0.05 1.60±0.25 1.38±0.160.96±0.08 251.47±188.66 ε3 256 3.63±0.89 1.31±0.11 2.31±0.20 0.75±0.04 1.55±0.23 1.31±0.131.03±0.09 264.35±179.87 ε4 10 3.71±0.79 1.24±0.12 2.82±0.15* 0.77±0.05 1.69±0.29 1.34±0.150.97±0.07 275.02±180.22 TG/（mmol/L）LDL-C/（mmol/L）sd-LDL-C/（mmol/L）HDL-C/（mmol/L）apo A/（g/L）apo B/（g/L）

2.5 apo E的等位基因ε3、ε4及血脂項目與LOAD發(fā)生的相關性

對AD組與正常對照組之間有明顯差異的血脂項目（TC、LDL-C、sd-LDL-C、HDL-C）及apo E的等位基因ε3、ε4進行多因素非條件Logistic回歸分析。結果顯示，apo E ε4等位基因和LDL-C升高是LOAD發(fā)生的危險因素[比值比（odds ratio，OR）值分別為14.454、5.824，95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）分別為5.793～16.368、2.582～7.973]，HDL-C升高是LOAD的保護因素（OR=0.020，95%CI為0.006～0.352）。見表5。

表5 LOAD危險因素的多因素Logistic回歸分析

3 討論

apo E主要在肝臟合成和代謝，可作為結構蛋白參與多種血漿脂蛋白的運輸和代謝，與血漿脂蛋白水平密切相關。apo E基因與血脂水平密切相關，其基因多態(tài)性是發(fā)生動脈粥樣硬化的主要影響因素，在心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中起一定的作用[5]。人類apo E基因主要由3種等位基因ε2、ε3和ε4編碼，根據(jù)不同的組合方式形成6種基因型（E2/2、E2/3、E2/4、E3/3、E3/4和E4/4）和3種表型（ε2、ε3和ε4）[6]。ε2表型也被稱為長壽型，對應的基因型為E2/2、E2/3，占7%；ε3表型即常見野生型，對應的基因型為E2/4、E3/3，占78%；ε4表型為高危型，對應的基因型為E3/4、E4/4，占15%。

本研究結果顯示，ε4表型者TC、LDL-C水平明顯高于ε2表型者，提示高TC血癥、高LDL-C血癥可能與apo E表型有關。在不同的人群中，apo E等位基因的分布頻率不同，因此表型頻率也有差異。本研究AD組apo E基因E3/4基因型頻率為最高，正常對照組則是E3/3基因型頻率最高；正常對照組ε3等位基因頻率最高，遠高于歐美人群，而ε4等位基因頻率則低于歐美人群，與文獻報道[7]一致，提示apo E基因頻率受地域和種族的影響較大。ZHAO等[8]的研究結果顯示，ε4等位基因可能是高脂血癥的重要病因?qū)W因素，我國人群ε4等位基因頻率低于歐美人群，可能與我國人群心腦血管疾病發(fā)病率低于歐美人群有關[8]。

在神經(jīng)元生長期間，apo E在中樞神經(jīng)系統(tǒng)脂質(zhì)平衡中發(fā)揮重要作用，但apo E在LOAD發(fā)生、發(fā)展中的作用仍存在一定的爭議。有研究結果顯示，apo E的等位基因是LOAD進展的標志[9]。也有研究認為apo E的基因型與腦梗死的發(fā)生、發(fā)展無關[10]。本研究結果顯示，AD組apo E E2/3和E3/3基因型頻率均低于正常對照組（P＜0.05），E3/4和E2/4基因型頻率均高于正常對照組（P＜0.01），表明在LOAD患者及健康人群中apo E基因型的分布存在差異。陳煜森等[11]對早發(fā)型AD患者和LOAD患者進行了apo E基因多態(tài)性檢測，但他們未檢測AD患者血清脂質(zhì)譜，也未分析AD的相關危險因素。本研究不僅檢測了LOAD患者的apo E基因多態(tài)性和血清脂質(zhì)譜，同時還采用多因素非條件Logsitic回歸分析評估了相關危險因素，結果顯示apo E ε4等位基因和LDL-C升高是LOAD發(fā)生的危險因素（OR值分別為14.454、5.824，95% CI分別為5.793～16.368、2.582～7.973），HDL-C升高是LOAD的保護因素（OR=0.020，95%CI 為0.006～0.352）。

有研究結果顯示，在認知正常的老年人群中，血清高TC水平與攜帶apo E ε4等位基因有關[12]，apo E ε4等位基因?qū)DL-C和HDL-C水平有影響[13]。李冬梅等[14]對散發(fā)性AD患者的apo E基因多態(tài)性和脂質(zhì)譜進行了研究，而本研究的研究對象是LOAD患者，二者研究對象不同，因此最后的結論也不盡相同。本研究結果顯示，ε4表型的AD患者血清TC及LDL-C水平明顯高于ε2、ε3表型的AD患者（P＜0.05），且apo E ε4等位基因和LDL-C升高是LOAD發(fā)生的危險因素，提示apo E可能參與了AD發(fā)生過程中脂質(zhì)代謝的特定病理生理機制。

BA等[15]的研究結果顯示，apo E ε4表型陽性的AD患者中Aβ淀粉樣蛋白的陽性率為95%。apo E ε4表型可調(diào)節(jié)局部腦葡萄糖代謝，影響AD發(fā)病過程中葡萄糖和淀粉樣蛋白代謝途徑的信號[16]。此外，還有研究結果顯示，apo E ε3等位基因攜帶者患者的血糖水平高于apo E ε4等位基因攜帶者[17]，apo E ε4等位基因攜帶者血糖升高程度與AD病理改變的嚴重程度有關[18]。由此可見，apo E基因在LOAD的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用，不僅影響Aβ淀粉樣蛋白沉積，對腦葡萄糖代謝也有影響。

本研究尚有局限性：本研究納入的對象地域范圍較窄，樣本量相對較小，后續(xù)研究將進一步擴大樣本量；此外，本研究僅分析了少量生化項目，后續(xù)研究將進一步擴展可能與AD相關的項目，如葡萄糖耐受程度及胰島素抵抗水平，進一步探討apo E基因多態(tài)性在LOAD中的作用機制及可采取的防治措施。