牙鲆耐低氧性狀相關的QTL 定位研究

翁歆之

(臺州市水產技術推廣總站，浙江 臺州 318000)

牙鲆(Paralichthys olivaceus)屬鰈形目、鰈亞目、鲆科、牙鲆亞科、牙鲆屬。分布于中國、日本和韓國等東北亞沿岸，是重要的經濟魚類，也是重要的海水養殖對象。其肉質細嫩、味道鮮美、營養豐富，還具有一定的藥用價值，深受人們的喜愛。近年來，牙鲆的自然資源衰退嚴重，進行大規模的人工養殖勢在必行。耐低氧性狀是高密度集約化養殖中最重要的經濟性狀之一，有研究表明，耐低氧能力與魚類的生長發育、攝食繁殖、代謝行為、免疫能力等有著密切的聯系。因此，篩選和培育出耐低氧的牙鲆優良品種是高密度、高效益養殖模式的迫切需要。

數量性狀基因座(quantitative trait locus，QTL)的檢測和定位是成功進行分子標記輔助選育(MAS)的重要前期工作。早期的QTL定位多見于植物、水稻、禽獸類等，水產經濟動物的QTL研究相對滯后。而關于牙鲆的QTL定位，特別是抗病、耐高溫等相關性狀的研究更是少之又少。如Fuji等篩選到了牙鲆抗淋巴囊腫病的性狀相關的主效位點，并培育出具有抗淋巴囊腫病的后代，成功應用到商業化生產；盧鐘磊等利用微衛星標記確定了兩個與牙鲆耐熱相關的位點；Ozaki等得到了牙鲆與海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)相關的QTLs；Wang等定位得到4個與牙鲆抗鰻弧菌病性狀相關的QTL區間。但是，關于牙鲆耐低氧相關的QTL定位尚未見報道。

本研究以167尾牙鲆F2KP-CBB家系作為實驗材料，采用140個微衛星分子標記，首次對牙鲆耐低氧性狀作QTL定位，以期為牙鲆分子標記輔助選擇育種提供基礎和依據。

一、材料與方法

1.實驗材料 以神奈川水產技術中心培育的牙鲆(長谷川研究員提供)為實驗材料。由親本KPC家系(耐低氧)與親本KP-B家系(不耐低氧)交配，獲得F1KP-CB，再由F1KP-CB與親本KP-B(不耐低氧)交配，獲得F2KP-CBB。

2.耐低氧實驗 將F2KP-CBB 167尾牙鲆個體放入內有800升海水的1000升圓形缸里(保持水溫25℃，溶氧11毫克/升)培育。實驗前1天將167尾個體(平均體長16.8厘米，平均個體重51.9克)轉移到1000升的圓形缸中，并放入親本KP-C、親本KPB、F1KP-CB各10尾作為對照樣本，禁食24小時。開始實驗時，整個實驗水溫保持25℃，止水，停止供給氧氣。在F2KP-CBB大概死亡一半的時候停止實驗(此時溶氧為0.9毫克/升)，按照死亡順序編號，并立刻剪下死亡個體的尾鰭，保存在99%酒精中。存活的牙鲆抽取血液，打入體內標記后返回缸中。整個實驗過程中對每個死亡個體都記錄下死亡時間，氧氣濃度每15分鐘記錄1次。

3.基因組DNA制備 用酚-氯仿抽提法進行基因組DNA提取，并用紫外分光光度計測量DNA濃度，將濃度稀釋至50納克/微升。

4.PCR擴增及聚丙烯酰胺凝膠電泳 利用PCR擴增方法對本實驗群體進行基因型檢測。PCR反應體系包括0.055皮摩爾特異性熒光引物(5’標記FAM熒光)0.005微升，下游引物0.05微升，10×Buffer(Mg2＋)1.1微升、2.5毫摩爾dNTPs 0.88微升、1%BSA 0.11微升、ExTaq DNA聚合酶0.055微升以及50納克的DNA模板1微升。PCR反應程序為：95℃預變性3分鐘；95℃變性30秒，62℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，共30個循環；72℃延伸5分鐘。PCR產物中加入等體積的loading dye(95%formaide，10毫摩爾EDTA，pH 8.0)，95℃變性5分鐘后迅速放到冰上。后經6%變性聚丙烯酰胺凝膠上點樣5微升，電泳1.5～2小時；在掃描儀(FLA-9000，FUJIFILM)上，使用Bio-image Analyzer軟件成像。

5.QTL定位及表型數據處理 參考Casta?o-Sánchez等構建的牙鲆高密度遺傳連鎖圖譜，選擇覆蓋牙鲆所有連鎖群的微衛星標記，共140個，平均間距10～15厘摩爾。

基因分型分兩步開展：先從F2KP-CBB中取出88尾個體(44尾死亡個體、44尾存活個體)，死亡個體取最開始死亡的44尾，對篩選的微衛星標記進行第一次檢測。然后，第一次檢測中表現出差異性的微衛星標記并加上其附近的微衛星標記對167尾個體進行第二次擴大檢測，統計基因分型。

采用應用軟件Map Manager QTXb20進行QTL定位，設定LOD值為3。根據實驗中牙鲆死亡時間，采用兩種不同模式進行分析，在模式一中，將死亡的44尾牙鲆定義為“0”，存活下來的44尾定義為“1”；模式二中，實驗所用167尾牙鲆按照死亡時間進行分析。

二、結果與分析

1.耐低氧實驗 耐低氧實驗進行了約9個小時，實驗結束時溶氧為0.9毫克/升。F2KP-CBB 167尾個體中75尾死亡(44.9%)、92尾存活(55.1%)，表明存活的個體比死亡的個體具有一定的耐低氧性。對照組中，KP-B全部死亡，KP-C的死亡率為30%，F1KP-CB死亡率為60%。

2.QTL定位 利用140對微衛星標記對F2KPCBB 88尾個體進行解析，其中90個(64.4%)標記統計得到基因分型結果。結果顯示(表1)，雌性遺傳圖譜上共檢測到6個標記與耐低氧性狀存在顯著的相關性(P＜0.05)，分別分布于連鎖群LG4、LG7、LG10和LG17上，4個標記與耐低氧性狀存在極顯著的相關性(P＜0.01)，都分布于連鎖群LG24上。其中LG24上的Poli1482TUF的LOD值最大，為2.08，可解釋的表型變異為10%。雄性遺傳圖譜上，共檢測到4個與標記耐低氧性狀存在顯著的相關性(P＜0.05)，分布于LG10、LG24上。

表1 F2KP-CBB 88尾個體耐低氧性狀相關QTL定位及其基因效應

利用上述有差異性表現的微衛星標記對于167尾個體進行擴大檢測，結果顯示(表2)，雌性遺傳圖譜上，共得到2個顯著性相關標記(P＜0.05)和7個極顯著性相關標記(P＜0.01)，分別分布于5個連鎖群(LG4、LG7、LG10、LG17和LG24)上。同樣LG24上Poli1482TUF的LOD值最大，為4.11，可解釋的表型變異為11%。

表2 F2KP-CBB 167尾個體耐低氧性狀相關QTL定位及其基因效應

三、討論

1.耐低氧實驗 在進行耐低氧實驗中，為了保證耐低氧實驗的準確性，因此在大約死亡一半并且溶氧達到0.9毫克/升時停止了實驗。

2.QTL 定 位 Casta?o-Sánchez 等 使 用 了1268個SSR標記、105個SNP標記和2個基因，構建了牙鲆第二代高密度遺傳連鎖圖譜，此圖譜由24個連鎖群組成，雄性和雌性圖譜總長度分別為1147.7厘摩爾和833.8厘摩爾。本研究基于該圖譜進行分析，可以較為準確地定位耐低氧相關性狀QTL區域。

本研究中，第二次擴大檢測得到的QTLs都定位于牙鲆的雌性遺傳基因圖譜上，這與Fuji等成功將褐牙鲆抗淋巴囊腫病的性狀相關QTL定位在雌性遺傳圖譜上的結論相一致。由于牙鲆的雌性遺傳圖譜的重組率高于雄性遺傳圖譜，因此定位于雌性遺傳圖譜的QTLs更適用于今后的分子標記輔助選擇育種。同時，本研究得到的極顯著標記Poli1482TUF(LG24)的LOD值為4.11，可解釋的表型變異為11%。有研究表明，可解釋的表型變異超過10%，即可有效地進行分子標記輔助選擇育種。

此外，本研究還嘗試在Poli1482TUF和Poli1024TUF附近設立了5對引物，試圖找到更大的LOD值，但尚未成功。今后將進一步對此區間進行分析，并將篩選到的Poli1482TUF放到更多的群體中進行進一步驗證。

四、結論

耐低氧性狀或抗病性狀，不像體長、體色、生長速度等可以從外觀直接進行選育，而分子標記輔助選擇育種可以精準、快速地選育出相關性狀的優良品種。本研究首次對牙鲆耐低氧相關性狀進行QTL定位，為今后牙鲆耐低氧性狀的分子標記輔助選擇育種奠定了基礎。