鏈脲佐菌素誘導(dǎo)小鼠糖尿病腎病模型的建立

王友娣 王李卓 高家林

【摘 要】目的：構(gòu)建糖尿病腎病小鼠模型。方法：選取120只健康雄性小鼠，隨機(jī)分成對(duì)照組（n=50）和糖尿病腎病組（n=70），對(duì)照組采用正常飲食喂養(yǎng)，糖腎組予以高糖高脂飲食喂養(yǎng)加鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射。收集對(duì)照組和糖腎組小鼠血液、尿液和腎臟標(biāo)本，測(cè)定血尿液生化指標(biāo)，腎臟病理切片染色觀察形態(tài)學(xué)改變情況，最終確定糖腎小鼠造模成功。結(jié)果：糖腎組小鼠隨機(jī)血糖高達(dá)16.7mmol/l，尿蛋白呈陽(yáng)性，血肌酐較對(duì)照組明顯增高。病理切片染色顯示糖腎組小鼠腎臟腎小球萎縮，腎小管基底膜增厚，腎臟纖維化水平明顯升高。結(jié)論：高糖高脂飲食聯(lián)合STZ腹腔注射是構(gòu)建小鼠糖尿病腎病模型的有效方法。

【關(guān)鍵詞】糖尿病腎病;血糖;血肌酐

【中圖分類號(hào)】R692【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1005-0019（2020）01--01

全世界糖尿病發(fā)病率的增加伴隨著糖尿病并發(fā)癥的同時(shí)增加，包括視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變和腎病。在這些并發(fā)癥中糖尿病腎病可能是最常見(jiàn)且危害最大的，導(dǎo)致大量的死亡率[1]。盡管近幾十年來(lái)對(duì)糖尿病腎病的研究已經(jīng)消耗巨大的公共衛(wèi)生資源，但其分子發(fā)病機(jī)制仍不清楚，近20多年來(lái)還沒(méi)有新的藥物用于治療糖尿病腎病[2]，此外，除了相對(duì)粗略的臨床指標(biāo)尿蛋白和血肌酐水平外，尚無(wú)可靠的生物標(biāo)記物可在臨床表現(xiàn)明顯的糖尿病腎病發(fā)生之前對(duì)高危患者進(jìn)行鑒別[3]。而在這些領(lǐng)域取得進(jìn)展的一個(gè)重要障礙是缺乏有效復(fù)制人類糖尿病腎病主要特征的動(dòng)物模型[4]。這種模型可以用來(lái)確定發(fā)病機(jī)制，確定藥物靶點(diǎn)和試驗(yàn)新的治療方法。小鼠由于其具有遺傳易操作性，被廣泛應(yīng)用于臨床模型中，包括糖尿病腎病（DN）[5]。本研究采用高糖高脂飲食喂養(yǎng)加STZ腹腔注射[6]誘導(dǎo)糖尿病腎病小鼠模型，通過(guò)生化指標(biāo)以及腎臟形態(tài)學(xué)檢測(cè)來(lái)判斷小鼠糖尿病腎病模型是否構(gòu)建成功。

一、材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性C57/BL6小鼠120只，8周齡，體重25-30g，購(gòu)買于南京青龍山動(dòng)物場(chǎng)，由皖南醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物房專門飼養(yǎng)。（2）儀器：全自動(dòng)生化分析儀（皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院）;血糖儀（美國(guó)強(qiáng)生公司）;代謝籠（皖南醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室）;冰凍切片機(jī)（美國(guó)Thermo公司）。（3）主要試劑：葡萄糖（西隴化工股份有限公司）;STZ（美國(guó)Sigma公司）;檸檬酸（上海生工生物工程股份有限公司）。

2.方法：選取120只健康雄性小鼠（8周齡，25-30g），隨機(jī)分成對(duì)照組（50只）和糖尿病腎病組（70只）。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，分別稱量對(duì)照組和糖腎組小鼠初始體重，提取小鼠腎臟、血液，進(jìn)行病理切片和血生化指標(biāo)檢測(cè)。隨后糖腎組小鼠給予高脂飲食喂養(yǎng)，對(duì)照組進(jìn)行正常飼養(yǎng)。四周后稱量并記錄小鼠體重，留取24h尿液測(cè)量尿白蛋白、尿肌酐等生化指標(biāo)。禁食12小時(shí)后隨機(jī)選取對(duì)照組、糖腎病組小鼠各3只，測(cè)量小鼠空腹血糖，之后采用眼眶取血法取血，用以測(cè)量生化指標(biāo)。剩余糖腎組小鼠給予腹腔注射小劑量的STZ（35mg/kg，1mol/L的檸檬酸緩沖液中，濃度為1%，PH4.5），誘導(dǎo)部分胰島素缺陷，注射時(shí)間控制在30min內(nèi)。對(duì)照組給予注射相同體積的檸檬酸緩沖液。之后糖腎組繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)，對(duì)照組正常飲食喂養(yǎng)。STZ注射后0-3周，每周稱量小鼠的體重、記錄體重變化。空腹?fàn)顟B(tài)下測(cè)量小鼠尾靜脈血糖并留取24h尿液。當(dāng)小鼠空腹血糖≥11.1mmol/L時(shí)，可初步認(rèn)為糖尿病小鼠模型成功，留24h尿液后殺鼠取血，測(cè)量生化指標(biāo)。待血糖≥16.7mmol/L后，且尿蛋白陽(yáng)性可認(rèn)為糖尿病腎病小鼠模型構(gòu)建成功。

3.本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件處理，計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]表示，行檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（）表示，行T檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.兩組小鼠血生化指標(biāo)比較：與對(duì)照組小鼠相比糖尿病腎病小鼠的空腹血糖、空腹HbA1c、腎臟指數(shù)均升高，血漿白蛋白下降，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.正常小鼠與糖尿病腎病小鼠腎臟形態(tài)學(xué)差異

接下來(lái)我們對(duì)糖尿病腎病小鼠腎臟進(jìn)行形態(tài)學(xué)染色，分別采取了HE、PAS、MASSON、PASM染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比較糖尿病腎病小鼠系膜細(xì)胞及基質(zhì)彌漫性增生，腎小球萎縮硬化，腎臟纖維化程度明顯。腎小球系膜增生系膜區(qū)隱約可見(jiàn)嗜復(fù)紅蛋白沉積。腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性或空泡變性。皮髓質(zhì)交界區(qū)和腎盂黏膜見(jiàn)灶性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

討論

目前，糖尿病腎病在全球發(fā)病率劇增，有研究預(yù)測(cè)至2035年全球的糖尿病患病人數(shù)將達(dá)到5.92億，且糖尿病腎病是發(fā)達(dá)國(guó)家中與糖尿病相關(guān)的最常見(jiàn)并發(fā)癥和死亡的主要原因。然而近幾十年來(lái)，臨床上尚無(wú)能針對(duì)性治療糖尿病腎病的藥物或其他治療方法[2，7]。因此，探索糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制并研究出有效的藥物治療糖尿病腎病迫在眉睫。這些都需要建立可靠的糖尿病腎病動(dòng)物模型，為研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

動(dòng)物模型可用于揭示人類疾病的發(fā)病機(jī)制，因?yàn)樗鼈兲峁┝伺R床研究中無(wú)法實(shí)現(xiàn)的精細(xì)實(shí)驗(yàn)策略[8]。根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院資助的糖尿病并發(fā)癥聯(lián)合動(dòng)物模型公布了一個(gè)糖尿病腎病嚙齒動(dòng)物模型的三個(gè)關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)：①肌酐清除率從初始開(kāi)始下降50%以上;②白蛋白尿（增高50倍）;③特征性病理改變，包括系膜基質(zhì)的擴(kuò)張，任何程度的小動(dòng)脈透明樣變，基底膜增厚和間質(zhì)纖維化。在許多領(lǐng)域，包括糖尿病研究，小鼠可以說(shuō)是人類疾病臨床前研究的首選實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀＿x擇小鼠模型的優(yōu)點(diǎn)包括它們相對(duì)低成本，繁殖力強(qiáng)，妊娠時(shí)間短，最重要的是遺傳操作的易處理性[9]。

本研究采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)小鼠5周后低劑量STZ注射（35mg/kg，1mol/L的檸檬酸緩沖液中，濃度為1%，PH4.5）誘導(dǎo)小鼠部分胰島素缺陷，待小鼠空腹血糖≥11.1mmol/l時(shí)可初步認(rèn)為糖尿病模型構(gòu)建成功，以后繼續(xù)喂養(yǎng)高糖高脂飼料直至血糖超過(guò)16.7mmol/l，血生化檢測(cè)出現(xiàn)大量蛋白尿，腎組織形態(tài)學(xué)染色提示系膜細(xì)胞和基質(zhì)彌漫增生，腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性、空泡變性，皮髓質(zhì)交界區(qū)和腎盂粘膜見(jiàn)灶性淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞浸潤(rùn)，均提示早中期糖尿病腎病模型形成，也表明高糖高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)是構(gòu)建糖尿病腎病小鼠模型的有效方法。糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)慢性過(guò)程，一旦進(jìn)入終末期腎衰將無(wú)法逆轉(zhuǎn)，因此早中期糖尿病腎病的防治將尤為重要[10]。但國(guó)內(nèi)外近幾年對(duì)早中期糖尿病腎病治療的研究仍未取得明顯療效，這其中一個(gè)重要原因便是缺乏能精確模擬人體糖尿病腎病重要特征的動(dòng)物模型[11]。而本研究構(gòu)建的早中期糖尿病腎病小鼠模型腎功能損傷較嚴(yán)重，且具有明顯的腎臟病理特征，為糖尿病腎病的研究提供了穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

Lee， J.Y.， et al.， Adiponectin for the treatment of diabetic nephropathy.Korean J Intern Med，2019.34（3）： p.480-491.

Gan， L.M.， et al.， Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type2diabetes.Nat Commun，2019.10（1）： p.871.

Krolewski， A.S.， et al.， Fast renal decline to end-stage renal disease： an unrecognized feature of nephropathy in diabetes.Kidney Int，2017.91（6）： p.1300-1311.

Dal Monte， M.， et al.， Inhibiting the urokinase-type plasminogen activator receptor system recovers STZ-induced diabetic nephropathy.J Cell Mol Med，2019.23（2）： p.1034-1049.

Kitada， M.， Y.Ogura， and D.Koya， Rodent models of diabetic nephropathy： their utility and limitations.Int J Nephrol Renovasc Dis，2016.9： p.279-290.

Rodionov， R.N.， et al.， ADMA reduction does not protect mice with streptozotocin-induced diabetes mellitus from development of diabetic nephropathy.Atheroscler Suppl，2017.30： p.319-325.

Tian， J.， et al.， Evidence and Potential Mechanisms of Traditional Chinese Medicine for the Treatment of Type2Diabetes： A Systematic Review and Meta-analysis.Diabetes Obes Metab，2019.

Ma， T.， et al.，4-O-methylhonokiol ameliorates type2diabetes-induced nephropathy in mice likely by activation of AMPK-mediated fatty acid oxidation and Nrf2-mediated anti-oxidative stress.Toxicol Appl Pharmacol，2019.370： p.93-105.

Subramaniam， A.， et al.， The Nile Rat （Arvicanthis niloticus） as a Superior Carbohydrate-Sensitive Model for Type2Diabetes Mellitus （T2DM）.Nutrients，2018.10（2）.

Gandhi， J.， et al.， Genitourinary Complications of Diabetes Mellitus： An Overview of Pathogenesis， Evaluation， and Management.Curr Diabetes Rev，2017.13（5）： p.498-518.

Zhu， J.， et al.， Predictive Model for Estimating the Cost of Incident Diabetes Complications.Diabetes Technol Ther，2016.18（10）： p.625-634.