miR-219靶基因HLA-G與胚胎停止發育相關性研究

張瑩 王敏 李江紅

【摘 要】目的：探討miRNA219靶基因HLA-G在胚胎停止發育中的表達及意義。方法：應用免疫組化LDP法以及Envision〔TM〕系統（K4001）（Dako公司產品）檢測135例胚胎停育婦女（實驗組）及65例正常早孕人工流產婦女（對照組）絨毛組織中的HLA-G。結果：我們發現在胚胎停育絨毛組織中，HLA-G低表達。而在正常流產絨毛組織中，HLA-G高表達。通過熒光素酶活性檢測、細胞轉染、組織芯片免疫組化檢測通過上調miR-219的水平，能夠在24h內迅速降低HLA-G的表達。結論：本研究通過對200例絨毛組織中的HLA一G蛋白的檢測，證實了在絨毛組織中，HLA-G起著關鍵的作用。觀察發現，miR-219和HLA-G的表達之間成負相關。

【關鍵詞】miRNA219HLA-G;表達負相關胚胎停止發育

【中圖分類號】R714【文獻標識碼】A【文章編號】1005-0019（2020）01--02

人類白細胞抗原-G（human leukocyte antigen-G，HLA-G）是1987年首次克隆出來的位于6號染色體短臂的一類免疫耐受分子[1]，具有選擇性組織分布的特點，其選擇性高表達于侵入子宮蛻膜的絨毛外滋養細胞，而此處恰恰不表達經典的HLA-A，B分子及DR，DQ和DP分子.在絨毛膜外細胞滋養層細胞，包括那些侵入子宮蛻膜的細胞滋養層細胞中HLA-G高表達;而在胎盤絨毛的合體滋養層中，HLA-G表達水平較低.絨毛膜細胞滋養層與絨毛膜外細胞滋養層的分化伴隨著細胞表面HLA-G分子表達水平的提高。

胚胎停止發育又稱稽留流產，是指胎兒或者胚胎組織已死亡滯留宮腔內未能及時自然排出者，表現為有或無任何癥狀，早孕的反應消失，子宮不再增大反而縮小。B型超聲檢查提示妊娠囊形態異常，無胎心搏動[2]。導致胚胎停止發育的原因十分復雜，目前已知的病因中有遺傳因素、生殖道結構異常、內分泌失調，細胞增殖和凋亡的失衡，免疫功能異常，全身感染性疾病、強烈應激與不良習慣，環境污染、食品安全、輻射和長期暴露于有毒化學物質環境以及孕婦高齡等[3]。但仍有超過50% 的胚胎停止發育原因不明。隨著二胎政策放開，近幾年來臨床工作中胚胎停止發育的發生及發展呈不斷上升的趨勢，目前迫切需要尋找與之密切相關的診斷位點對于其臨床診斷和治療有著十分重要的意義。

近年來研究[4]提示，miRNA 在稽留流產的發生機制中發揮重要作用。而且有大量的研究表明[5，6]，在胚胎干細胞、著床后胚胎等過程中均有 mi RNA 的表達，例如R-125a，miR-295，miR-181b及miR-219等等都與胚胎發育有關。前期我們曾應用：RT-PCR檢測表明 ，胚停育組miRNA219表達明顯高于對照組.為此，我們進一步研究了miRNA-219在稽留流產中的表達和功能、相關靶基因以了解其之間的相關性。

我們通過TargetScan軟件對miR-219靶基因進行預測，并結合一些文獻查閱，在多個潛在的靶基因中選取了HLA-G進行定量PCR檢測。

在進一步的研究中，我們旨在調查 HLA-G在臨床胚胎停止發育的絨毛組織和正常流產的絨毛組織中的表達水平，進而進一步檢測胚胎停止發育患者絨毛組織中miRNA219的表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 方法

實驗組：選取2016年7月至2017年7月于濰坊市婦幼保健院產科及計劃生育科就診的135例胚胎停止發育（年齡24～46歲，年齡中位數為34.3歲）的患者，孕7～12周， 平均孕10周， 既往身體健康， 無子宮肌瘤、卵巢囊腫、子宮形態異常、慢性感染等生殖器官疾病。胚停育的診斷標準：B超提示（1）妊娠囊不增長、變形， 輪廓模糊， 小于妊娠月份;（2）胚芽枯萎縮小或無心血管搏動[7]， 經1周后復查無改變。

對照組：同期隨機抽取孕7～12周要求人工流產者65例，年齡21～44歲， 平均32.2歲， 既往無不良孕產史， 無其他婦產科合并癥。見表1。

兩組孕婦在年齡、孕周、生育史等方面比較，差異無統計學意義（P >0.05），具有可比性。

1.2 標本采集

實驗組和對照組均采用負壓吸宮法， 無菌操作取部分絨毛，用免疫組化LDP法以及Envision〔TM〕系統（K4001）（Dako公司產品）分別從胎停育絨毛組織和正常絨毛組織中提取HLA-G，以觀察其在兩組中的表達情況。

1.3 統計分析

使用 SPSS 統計軟件包（IBM SPSS Statistics數據編輯器19）進行統計分析。計量資料以 ?表示，兩組間比較采用 t 檢驗，多組間采用方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

我們發現在胚胎停育絨毛組織中，HLA-G低表達。而在正常流產絨毛組織中，HLA-G高表達。前期我們進行了miR219在兩組組織中的研究，發現在胚胎停育組miR219高表達。通過熒光素酶活性檢測、細胞轉染、組織芯片免疫組化檢測通過上調 miR-219的水平，能夠在24h 內迅速降低HLA-G的表達，這說明 miR-219對 HLA-G 有著明顯的調控作用。

討論

本研究通過對200例絨毛組織中的HLA-G蛋白的檢測，證實了在絨毛組織中，HLA-G起著關鍵的作用。觀察發現，miR-219和HLA-G的表達之間成負相關。HLA-G作為一種非經典 HLA-I 類分子，在母-胎免疫耐受及維持正常妊娠中起重要的免疫調節作用[8-9]。HLA-G 分子主要存在于絨毛遠端的細胞滋養層。其通過與免疫活性細胞（如殺傷性 T 細胞、NK 細胞等）和有關因子如 IL-2等發生作用，阻斷母體對胎兒的免疫應答，保護妊娠順利進行。在胚胎著床期間，子宮蛻膜有大量浸潤的免疫活性細胞，其中大多數是 NK 細胞，而HLA-G 能抑制 NK 細胞的殺傷活性。因此，HLA-G 的減少可能使滋養細胞易受母體免疫系統攻擊，影響著床和妊娠維持，從而導致妊娠的失敗。通過我們的研究，我們希望揭示miR-219在臨床應用方面的價值。我們的研究將為設計針對miR-219的靶向藥物提供充分、可靠的理論依據，為解決患者今后的胚胎質量提供新思路，以達到優生優育的目的。

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