傷寒沙門菌不同生長期和不同應激下非編碼RNA ArpH的表達

熊昌艷，李雪嬌，黃新祥

(江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013)

傷寒沙門菌(Salmonellaentericaserovar Typhi，S.Typhi)是沙門菌屬中一種重要的人類致病菌，多種毒力基因的作用可引起輕度腹瀉甚至是嚴重的全身性感染[1]。傷寒沙門菌在感染過程中通過調節毒力基因的表達而迅速適應環境的變化。傷寒沙門菌的致病過程很復雜，涉及相關基因的活化和抑制以適應新的環境[2]。此外，各類調節因子，雙組分調節系統(two-component regulatory systems，TCSs)，蛋白修飾水解酶和σ因子等均參與了致病過程[3]。近年來隨著研究的深入，和大腸埃希菌一樣，傷寒沙門菌已成為重要的模式生物，其對環境應答的基因表達，特別是與宿主作用的毒力因子的表達調節網絡機制，已成為研究的熱點。

許多非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)通過多種機制參與調節不同生物過程中相關基因的表達[4-5]。本實驗室應用深度測序分析發現了數個細菌中的ncRNAs[6-8]，其中包括與rpoHmRNA互補的順式編碼ncRNA ArpH[9]。本研究利用RNA印跡和qRT-PCR等技術，對ArpH在不同生長時期和不同應激條件下的表達、雙組分調節系統和氧應激調節因子對其調控作用進行分析，以期探討ArpH在傷寒沙門菌致病中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株

傷寒沙門菌GIFU 10007、ompR缺陷株(ΔompR)、rcsB缺陷株(ΔrcsB)和oxyR缺陷株(ΔoxyR)由本實驗室保存。

1.2 主要試劑與材料

酵母提取物、胰蛋白胨粉(英國Oxoid公司)；NaCl、NaOH、HCl、無水乙醇、異丙醇、枸櫞酸鈉、EDTA-Na2·2H2O(國藥集團上海化學試劑公司)；特異性引物和探針(蘇州泓迅生物科技有限公司)；DIC Northern試劑盒(瑞士Roche公司)；HybondTM-N+尼龍膜(美國GE Healthcare公司)；RNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)；PrimeScript反轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)。

1.3 主要儀器

PCR儀2720 Thermal Cycler(美國ABI公司)；瓊脂糖電泳儀(南京新校園生物技術研究所)；Northern核酸雜交儀(英國Roller-Blot公司)；熒光定量PCR儀CFX96TMReal-Time System和PAGE凝膠電泳槽(美國Bio-Rad公司)。

1.4 細菌培養和總RNA提取

挑取單克隆細菌于LB液體37℃過夜培養，按1 ∶100轉接于相同條件LB液體培養基，分別培養至不同生長時期[D(600 nm)為0.3、0.8、1.3和2.0分別代表對數早期、對數期、對數晚期和穩態期]，收集細菌。采用TRIzol法提取細菌總RNA后，用2 μL(1 U/μL)DNA酶Ⅰ 37℃ 30 min、1 μL(1 U/μL)DNA酶Ⅰ 80℃ 2 min去除混雜的少量DNA，酚仿-乙醇法純化。取適量RNA用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。

將傷寒沙門菌培養至對數期后分別給予酸、高滲、氧應激培養30 min和42℃熱應激(10、20、30 min)，分別收集細菌，上述方法提取RNA。酸應激組細菌添加濃鹽酸，使最終pH=4.5；高滲應激組添加5 mol/L的NaCl溶液1.06 mL；氧應激組添加30%的H2O210 μL；對照組不做處理。

1.5 RNA印跡檢測ArpH RNA表達

用ArpH特異性cDNA探針檢測ArpH。利用Oligo 6軟件，根據arpH的核苷酸序列設計RNA印跡探針ArpH-NR(5′-AGGGCGATCTGGAAGCAGCT-AAAACGCTGATCCTGTCTCACCTGCGCTTTGTTG-3′)。5S rRNA為內參(5S-NR：5′-CTACCATCGGCGCTACGGCGTTTCACTTCTGAGTTCGGCATGGGGTCA-GGTGGGA-3′)。取200 ng純化的探針DNA用DIC Northern試劑盒體外轉錄并標記探針。反應完成后加入1 μL(10 U/μL)DNA酶Ⅰ 37 ℃消化30 min，2 μL 0.2 mol/L EDTA終止反應。加入DEPC水使總體積達到50 μL。加入1/10體積的5 mol/L乙酸銨和3倍體積預冷的無水乙醇，-20 ℃放置2 h，12 000 r/min、4 ℃離心20 min，75%乙醇漂洗，空氣干燥。用50 μL DEPC水溶解，應用核酸檢測儀檢測探針濃度；應用10%的尿素變性PAGE電泳檢測探針質量。剩余探針加入20 U RNA酶抑制劑，-80 ℃保存待用。在含有7 mol/L尿素的6%聚丙烯酰胺凝膠上分離出10～20 μg總RNA，并電印跡到HybondTMN+尼龍膜上(300 mA 40 min)。轉膜完成后用2×SSC洗膜2次。80 ℃干燥2 h，固定RNA。膜固定后，用DEPC水洗膜3次，加入5 mL Rhoche雜交液，55 ℃預雜交1 h。棄去雜交液，加入5 mL新的雜交液，將探針90 ℃變性后添加到雜交液中過夜。次日洗膜并孵育地高辛抗體，用化學發光凝膠成像儀曝光顯影。

1.6 qRT-PCR檢測ArpH RNA表達

利用Oligo 6軟件，根據arpH的核苷酸序列設計特異性引物RT-PA(5′-CTCATCGTCCGAAGACAT-3′)和RT-PB(5′-CGTTAAAGTCGCAACCAC-3′)。5S rRNA為內參(5S-A：5′-TTGTCTGGCGGCAGTAGC-3′；5S-B：5′-TTTGATGCCTGGCAGTTC-3′)。提取不同生長時期和不同應激(酸、氧、高滲)條件下的細菌總RNA各4 μg，用隨機引物將RNA反轉錄成cDNA，再以ArpH RT-PA/RT-PB進行qRT-PCR。使用qRT-PCR儀監測反應，并使用2-ΔΔCT方法進行標準化[10]。

將傷寒沙門菌培養至對數期后分別給予42 ℃熱應激10、20、30 min，提取不同時間段RNA做qRT-PCR。選擇ompR、rcsB和oxyR基因缺陷變異株培養至生長對數期，提取RNA后消化殘余DNA，用隨機引物反轉錄成cDNA后進行qRT-PCR。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 不同生長期傷寒沙門菌ArpH的表達

qRT-PCR結果顯示(圖1A)，ArpH在細菌生長的對數晚期時表達量最高，從對數早期到對數晚期的過程中，表達量逐漸增加，而進入穩態期后有所回落。

RNA印跡結果顯示(圖1B)，ArpH在對數晚期條帶最濃，對數早期條帶最淡，與定量結果一致。

A: 實時定量PCR；B: RNA印跡

2.2 酸、高滲、氧應激下傷寒沙門菌ArpH的表達

RNA印跡(圖2A)和qRT-PCR(圖2B)結果顯示，ArpH表達水平在酸應激下明顯下降(P<0.01)，氧應激下明顯增高(P<0.01)，而高滲應激下則無明顯變化。

A: RNA印跡；B: 實時定量PCR

2.3 熱應激下傷寒沙門菌ArpH的表達

如圖3所示，42℃熱應激10、20、30 min對ArpH表達無明顯影響(F=1.066，P=0.430 9)。

圖3 熱應激下傷寒沙門菌ArpH的表達

2.4 ompR、rcsB和oxyR基因對傷寒沙門菌ArpH表達的影響

qRT-PCR結果顯示，ompR、rcsB和oxyR基因缺失時，傷寒沙門菌ArpH表達量均明顯下調(圖4)。

*：P<0.01，與野生株比較

3 討論

ncRNA對細菌適應特定生長環境具有調節作用[11]。沙門菌和其他細菌一樣，擁有一套適應環境的調節系統，該系統允許它在感染動物的每個階段的惡劣環境下進行繁殖。例如被攝取后，沙門菌必須首先應對溫度升高之后胃的酸性環境，在腸內又受到滲透壓增加、氧分壓降低等因素影響，以及與腸道正常菌群的競爭[12]。沙門菌隨后可以進入非吞噬細胞和吞噬細胞并在其中增殖，細菌抵抗細胞內防御，該過程涉及抗菌肽、含沙門菌液泡的酸化、活性氧和氮的產生等機制。為了應對這些應激條件，傷寒沙門菌必須快速調節其轉錄前體，這可能與ncRNA介導的快速基因調節有關。監測ncRNA表達可以揭示與沙門菌在宿主細胞內生存策略相關的誘導模式[13]。

隨著arpH基因位置的確定[9]，本研究進一步分析了ArpH的表達特性，結果顯示ArpH在細菌生長的對數晚期表達量最高，從對數早期到對數晚期的過程中，表達量逐漸增加，而進入穩態期后有所回落。這表明ArpH可能在傷寒沙門菌生長的對數晚期發揮了重要作用。

本研究在體外模擬了傷寒沙門菌感染人體時可能遭遇胃酸、高滲腸道液及吞噬細胞內活性氧這3種不同的應激環境，RNA印跡和qRT-PCR結果顯示，ArpH表達水平在酸應激下明顯下降，氧應激下明顯增高，而高滲應激下則無明顯變化。這提示細菌可能通過下調ArpH的水平來參與傷寒沙門菌對酸的應激。而在氧應激下，ArpH表達上調有助于細菌在宿主細胞內發揮抗氧化作用。

在暴露于熱應激后，幾乎所有生物體的細胞瞬時增加了一組熱休克蛋白(heat shock proteins，hsps)的合成，這些分子通常是分子伴侶和蛋白酶。這種反應稱為熱休克反應，最大限度地減少了熱變性和蛋白質聚集所造成的損害。大腸埃希菌的RNA聚合酶含有σ32(rpoH的基因產物)，它參與了許多熱休克蛋白基因的轉錄。有實驗表明當溫度從30°C突然升至42°C時，6 min后σ32的水平增加了約17倍，15 min后下降至5倍[14]。arpH基因定位圖顯示ArpH完全覆蓋了rpoH的編碼區，提示rpoH可能是ArpH的靶基因[9]。因此，我們探討了熱應激不同時間ArpH的表達水平。結果表明熱應激并未影響ArpH的表達。上述結果表明ArpH可能并不參與熱應激時rpoH的表達調控。但在其他高溫或低溫情況下是否發揮作用尚待進一步研究。

細菌的基因表達還可受各種調節(蛋白)因子的影響。雙組分調節系統由位于細菌胞膜上的感受蛋白和胞內效應調節蛋白構成，在各種應激環境的基因表達調節中至關重要。感受蛋白多為ATP依賴性蛋白激酶，在外部環境的刺激下，胞內近C末端的組氨酸殘基可磷酸化，然后再將磷酸基團特異性地傳遞給胞內特殊的調節蛋白天門冬氨酸殘基，使其磷酸化并改變蛋白構象及活性，從而影響對相關基因的轉錄表達[15]。OmpR與EnvZ構成雙組分調節系統，除調節膜通道蛋白OmpC和OmpF表達外，還與沙門菌SPI-1和SPI-2基因表達調節有關[16]。本研究分析了傷寒沙門菌雙組分調節系統(OmpR、RcsB)和氧應激調節因子OxyR對ArpH的影響。實驗結果表明，當ompR、rcsB和oxyR基因缺失時，ArpH表達量均明顯下調，表明傷寒沙門菌雙組分調節系統OmpR、RcsB和氧應激調節因子OxyR對ArpH均有正向調控作用。

綜上所述，本研究初步探討了傷寒沙門菌在不同生長時期和不同應激條件下ncRNA ArpH的表達特性。結果提示ArpH參與了傷寒沙門菌對酸、氧應激的調節；雙組分調節系統OmpR、RcsB和氧應激調節因子OxyR對ArpH均有正向調控作用。本研究為進一步深入探討ArpH的作用機制提供了基礎。