氣體信號分子硫化氫在腫瘤發生發展與治療中的作用研究進展

葉洋，葉芬，李雪，周建偉，許文榮，陸榮柱

(1.江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013；2.南京醫科大學公共衛生學院，江蘇 南京 210029)

近年來，我國惡性腫瘤的發病率不斷上升，防治形勢嚴峻[1]。硫化氫(Hydrogen sulfide，H2S)通常被認為是一種有臭雞蛋氣味的環境污染物，然而隨著近年來研究的不斷深入, H2S被發現作為一種內源性氣體分子，對機體具有廣泛的生理藥理學效應，但其與腫瘤的關系一直缺乏明確的結論。最近的研究表明，結腸癌、卵巢癌、乳腺癌等惡性腫瘤中H2S生成酶胱硫醚-β-合酶(cystathionine-β-synthase，CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)的表達增加，在這些癌癥中應用CBS或CSE藥理學抑制劑或基因沉默可在體外抑制癌細胞生物能量代謝，抑制體內腫瘤生長和轉移，增強一線化療藥物的抗腫瘤作用，同時也有研究發現內源性H2S水平較低時主要表現為促癌作用，而暴露于H2S水平較高(多由外源添加產生)或較長時間則更可能表現為抑癌效應[2]，為此“鐘形模型”或低、高濃度的“雙相作用”模型可進一步闡明H2S在腫瘤發展中的作用[3]。本文就H2S在腫瘤發生發展與治療中的研究狀況進行相應分析，為以靶向調控H2S的藥物應用于臨床腫瘤治療，開展基于H2S的腫瘤防治策略提供重要依據。

1 H2S的代謝及其調控

H2S具有極強的脂溶性，可自由穿過細胞膜。H2S廣泛存在于人體各個部位，具有多種生成轉化方式[4]。其中在細胞質內主要通過CBS和CSE以L-半胱氨酸為底物催化產生；在線粒體中，主要通過巰基丙酮酸轉硫酶(3-mercaptopyruvate sulfuransferase，3-MPST)以巰基丙酮酸為底物催化產生H2S[5](圖1)。其中CBS 和CSE是依賴于5’-磷酸吡哆醛(PLP)的，同時也是催化產生H2S的主要途徑,因而調節CBS和CSE這兩種酶活性可直接影響H2S的生成量。前者主要分布在中樞神經系統中，后者則主要分布于外周器官如心血管系統[6]，同時在肝、腎、胰和胃腸道等組織中這三種酶的含量也很豐富，在這些組織的腫瘤組織中，這三種酶的表達都有相對應的升高趨勢[7]。機體中的H2S主要以硫氫根離子(HS-)、二價硫離子(S2-)的形式存在，只有1/3 H2S以分子形式存在。此外H2S 與硫氫化鈉(NaHS)在體內維持著動態平衡，在體內NaHS可解離為鈉離子和HS-離子，后者與體內氫離子結合后生成H2S。

圖1 H2S產生的3條經典途徑

H2S在體內含量很低，但可對機體的心血管、消化、神經、呼吸等多系統產生廣泛影響，同時也調控各大系統惡性腫瘤的發生發展[8]。隨著H2S與腫瘤的研究日益深入，越來越多的H2S供體被投入到腫瘤研究中，如NaHS、S-炔丙基半胱氨酸(SPRC)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、透明質酸與5-(4-羥基苯基)-3H-1，2-二硫醇-3-硫酮產生的共軛物(HA-ADT)、GYY4137等[9]。

2 H2S在腫瘤中的作用及其機制

2.1 H2S與乳腺癌

相對于正常乳腺細胞MCF-10A，乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231的CSE有較高水平的表達。CSE啟動子可與STAT3直接結合，從而使CSE轉錄被激活，促進乳腺癌內源性H2S生成[10]。藥理學抑制(DL-炔丙基甘氨酸PAG)和基因學干預(CSE siRNA)下調CSE的表達在抑制乳腺癌細胞內源性H2S生成的同時，也可顯著抑制乳腺癌細胞系的增殖和遷移能力、促進其凋亡。同時CBS在乳腺癌細胞中高表達，也是腫瘤細胞來源H2S的主要供體生成途徑之一，可促進乳腺癌的發展，此外，H2S的釋放能明顯抑制乳腺癌細胞的凋亡[11]。

不同濃度的H2S在乳腺癌細胞中顯現了相反的效應，即在低濃度H2S(供給NaHS<200 μmol/L)作用下，主要表現為促進乳腺癌生長、遷移；而在較高濃度H2S(供給NaHS>1 000 μmol/L)影響下，則表現出明顯的抑癌作用。為了明確不同濃度H2S對乳腺癌發生發展的影響，有研究應用了NaHS(20～2000 μmol/L)作為H2S供體，通過對細胞周期調節蛋白等的檢測，顯示高劑量和持續暴露H2S(72 h)對三陰性乳腺癌細胞增殖具有明顯的抑制作用，同時，較高水平的NaHS(>200 μmol/L)可以抑制細胞內黏附分子ICAM-1從而抑制三陰性乳腺癌的侵襲能力。此外，在一定程度上激活CSE/H2S途徑可降低p-p38的表達，抑制乳腺癌細胞的侵襲和上皮間充質轉化[12]。另外，相同作用條件下(200 μmol/L，48 h)，透明質酸共軛物HA-ADT作為新研發的H2S供體，在MCF-10A, MCF-7和MDA-MB-231細胞中能釋放比NaHS和 GYY4137高1.5～3倍的H2S，HA-ADT主要通過抑制PI3K/mTOR和Ras/ERK信號通路從而抑制人乳腺癌細胞的生長[13]。

在裸鼠實驗中，H2S在乳腺癌細胞中的作用與細胞模型一致，在人乳腺癌細胞MDA-MB-231異種移植瘤的動物實驗中，較低劑量的NaHS供給H2S可促進瘤體生長，而高劑量NaHS則抑制了瘤體的大小及重量[14]。此外，透明質酸共軛物HA-ADT能穩定釋放大量H2S氣體，在成瘤小鼠體內每天皮下注射200 μmol/L HA-ADT 14 d后可通過抑制PI3K/ERK通路在乳腺癌移植瘤裸鼠模型中明顯抑制腫瘤生長和血管生成[13]。

2.2 H2S與甲狀腺癌

研究發現NaHS在25～50 μmol/L濃度區間處理24～48 h可促進人甲狀腺癌細胞的增殖、存活、遷移及侵襲。在甲狀腺癌中H2S主要通過ROS/PI3K/mTOR和RAS/ERK等信號通路影響腫瘤細胞的發生發展[15]。相對于正常非腫瘤組織，CBS蛋白在幾種不同的人類惡性腫瘤中都有較高表達，其中在人甲狀腺癌細胞中過表達的主要是CBS，且與腫瘤分期、轉移和化療耐藥等參數相關的蛋白表達增加[16]。H2S作為血管松弛劑可以舒張血管，可增大腫瘤細胞附近血流量，促進增殖和遷移，采用藥理學抑制[氨基氧乙酸(AOAA)]或基因學抑制(CBS siRNA)下調CBS，可以減少內源性H2S的產生，從而抑制腫瘤細胞的增殖、遷移，并促進腫瘤細胞凋亡。同時沉默CBS基因可以減少細胞線粒體的呼吸作用，抑制ATP的合成，熱量限制導致能量供應不足從而使機體新陳代謝等降低，進而抑制腫瘤的形成。

相反的，在200 μmol/L 的高濃度NaHS作用后，ROS水平反而明顯升高，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-ERK1/2等蛋白水平明顯下調，進而使甲狀腺癌細胞的增殖、遷移及侵襲被明顯抑制[16]。說明在人甲狀腺癌細胞中，呈現低濃度H2S能明顯促進人甲狀腺癌細胞增殖、遷移，外源性H2S供體提供高濃度H2S后則反向抑制人甲狀腺癌細胞增殖、侵襲等。

同時，在人甲狀腺癌移植瘤的裸鼠實驗中，用不同濃度的NaHS瘤周皮下給藥4周，發現較低劑量組NaHS[1.4～2.8 mg·(kg·d)-1]對腫瘤生長和血管形成有促進作用。此外，在人甲狀腺癌TPC-1、TT和ARO細胞異種移植瘤的動物實驗中，以瘤體的Ki67和CD31等為指標，發現高劑量組NaHS[11.2 mg·(kg·d)-1]可明顯抑制腫瘤生長和血管生成[15]。

2.3 H2S與結直腸癌

結直腸癌是消化道惡性腫瘤之一，H2S在結直腸癌中的作用機制較復雜，因H2S可由腸道細胞和腸道細菌生物同時合成，故可在大腸中達到較高水平[17]。將患者結腸癌標本與相匹配的正常黏膜組織進行比較后發現CBS選擇性升高，其產物H2S在結直腸癌細胞中也明顯上調，它們在腫瘤的生長和進展中起重要作用[18-19]。隨后，在結腸癌細胞株(HCT-116, HT-29, LoVo)中也發現CBS 呈選擇性上調。NCM 356細胞中CBS的上調可誘導轉錄組的廣泛變化，代謝組學分析提示高表達CBS激活了磷酸戊糖和糖酵解途徑，通過NF-κB、KRAS、p53和Wnt等信號的調控，促進細胞增殖、遷移、侵襲，顯示CBS/H2S軸的激活促進了結腸癌的發生發展，并且這種作用能被CBS的特異性抑制劑AOAA所抑制[20]。

相反的，也有研究表明在大腸癌細胞株CaCO2中，使用H2S供體100 μmol/L GYY4137處理細胞24～48 h后H2S濃度升高(產H2S的峰值比100 μmol/L的NaHS高將近3倍)，可通過調節增殖、凋亡等途徑明顯抑制細胞活力。目前的研究已經初步明確了H2S在低濃度范圍內促進結直腸癌以及在高濃度區間(多由外源性供體提供)抑制腫瘤進展的雙向作用。因此H2S釋放劑、H2S合成酶的抑制劑等得到了廣泛研究[21]。研究證明SW480結直腸癌細胞中用H2S供體NAC處理后，可促進線粒體酶3-MPST及內源性H2S產生增加，通過線粒體代謝重新編程來促進結直腸細胞抵抗氧化應激的能力[22]。此外，丁酸鹽和NaHS都可以使結腸癌中的CBS和CSE呈高表達狀態，使體內H2S產生過多，并且均呈劑量依賴性地降低細胞活力，同時用CBS抑制劑或CBS siRNA減少CBS的表達可逆轉丁酸對結直腸癌細胞活力的抑制[23]。此外，較高濃度的H2S還可通過激活ERK、p38 MAPK的磷酸化抑制結腸癌細胞的增殖。

在裸鼠體內移植HCT 116細胞或SW480細胞后，沉默CBS表達或用AOAA藥物抑制CBS表達使內源性H2S生成較少，明顯降低移植瘤的生長速度，同時腫瘤血管生成減少，在腫瘤實質內直接注射AOAA可減少瘤周血流量[3]，除抑制原發性腫瘤生長外，CBS抑制AOAA還可減少HCT 116細胞轉移灶的數目[24]。因而提示下調內源性H2S能有效抑制結腸癌的發展，也從側面反映出內源性H2S的促癌能力。相反的，研究表明一種新型H2S供體萘普生(HS-NAP)能釋放H2S，HS-NAP作用于異種移植HT-29人結腸癌細胞的小鼠模型后，可通過減少體內NF-κB水平，明顯下調移植瘤的體積和質量，同時抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡[25]。

2.4 H2S與胃癌

與正常胃黏膜上皮細胞相比，胃癌細胞中CBS和CSE的表達相對較高，同時降低CBS和CSE的表達水平后，可以顯著抑制胃癌細胞的增殖。此外，H2S可通過調控 MMP2 和 MMP9 基因促進血管生成，影響胃癌細胞增殖和遷移過程。胃癌細胞AGS中高表達CSE，用CSE抑制劑PPG和BCA下調內源性H2S產生量后，AGS細胞增殖水平明顯被抑制，進一步證明了內源性H2S可促進胃癌細胞增殖[26]。此外，用紅參提取物(KRGE)處理胃癌細胞株后，CBS和CSE的表達水平明顯降低，進而可通過下調內源性H2S從而發揮抑癌效應[27]，同時，H2S本身卻又可通過AMPK通路的激活在一定程度上保護正常非腫瘤胃組織[28]。

相反的，高濃度NaHS作用后可明顯誘導胃癌細胞凋亡，同時抑制癌細胞遷移和侵襲，發揮H2S的抗癌效應[29]。同時H2S也可在胃癌細胞中特異性抑制甘露糖α-1,6-糖蛋白β-1,6-N-乙酰葡糖氨基轉移酶(MGAT5)的表達，有效降低胃癌中異常糖蛋白的表達，進而抑制胃癌細胞的發生發展[30]。此外，S-炔丙基半胱氨酸(SPRC)作為H2S供體，能明顯增加CSE及內源性H2S水平，具有抑制SGC-7901胃癌細胞增殖和遷移，促進胃癌細胞凋亡的功能。

鼠源性胃癌細胞中的CBS和CSE表達水平也明顯增高，用特異性抑制劑(AOAA、PAG)作用于荷瘤小鼠后明顯抑制了瘤體大小及重量，并且減少了血管生成，因而提示H2S在一定濃度范圍內能發揮促癌作用，用相應的抑制劑抑制H2S生成酶后能有效緩解其促癌效應。體內研究顯示，腹腔注射50 mg/kg和100 mg/kg的H2S外源性供體SPRC可顯著降低裸鼠移植瘤的重量和體積，腫瘤生長抑制率為40%～75%，且該抑制效應可被CSE活性抑制劑PAG阻斷[31]。表明在胃癌體內外模型中，H2S都能發揮其鐘形效應。

2.5 H2S與肝癌

HepG2細胞中CBS高表達，姜黃素和海帶提取物對其聯合作用后CBS表達下降，內源性H2S呈劑量依賴性下降，進而抑制細胞增殖和轉移相關蛋白的表達，表現出對增殖和轉移的抑制作用。CBS在人肝癌HepG2和SMMC-7721細胞中呈高表達，用喹諾酮-吲哚酮偶聯物QIC2抑制內源性CBS/H2S水平，可顯著降低細胞的活力和生長速率，觸發細胞凋亡等[32]。此外，抑制CBS/H2S通路可導致肝癌細胞HepG2和PLC/PRF/5內產生ROS，引起線粒體的崩解，進而誘導DNA損傷和細胞凋亡[33]。這些研究結果從側面證明了一定濃度范圍內的內源性H2S能在腫瘤中發揮促癌作用，而在此基礎上下調H2S生成酶如CBS，能反向發揮抑癌作用。

相對較低水平的H2S主要發揮促進肝癌細胞生長的作用，而高濃度的H2S則可能表現出對肝癌細胞生長的抑制作用，在肝癌細胞中主要通過EGFR/ERK/MMp-2和PTEN/AKT信號通路實現[34]。此外，在人肝癌細胞HepG2 和 Bel7402中，H2S供體GYY4137 400 μmol/L處理24 h可通過抑制p-STAT3的激活達到抑制肝癌細胞增殖的作用，同時促進肝癌細胞的凋亡，抑制肝癌的遷移能力。

在肝癌的體內實驗中也存在H2S的雙向作用，研究表明，用較低劑量組NaHS作用于人肝癌移植瘤的裸鼠，主要表現其促癌效應，使瘤體增大，血管生成增多；而較高劑量組NaHS則主要發揮其抑癌作用。此外，目前已有研究發現H2S供體NaHS 和 GYY4137可通過阻斷STAT 3和NF-κB下調肝癌細胞吲哚2，3-雙加氧酶1(IDO1)的表達，抑制肝癌荷瘤小鼠腫瘤的發生發展[35]。

2.6 H2S與神經膠質瘤

在神經膠質瘤中，低濃度H2S在腦部可拮抗ROS引起的氧化應激作用，保護神經膠質瘤細胞，進而促進腫瘤的發生[36]。此外，通過H2S供體或提高相關酶類活性及表達的藥物可增加內源性H2S濃度，H2S生成水平升高后激活p38MAPK和Cox-2等通路，進而促進C6膠質瘤細胞的生長，抑制其凋亡[37]。相關實驗已證明生理濃度的內源性H2S可通過抑制JNK、p38和ERK1/2磷酸化，促進Nrf2活化，發揮減輕氧化應激反應和抗凋亡等作用, 在一定程度上可促進神經膠質瘤細胞生長[38]。

另一方面，研究表明H2S可通過聚硫反應產生多硫化物，多硫化物可顯著抑制小鼠神經膠質瘤細胞N2A的生長并能促進神經元細胞突起的生長，促進其分化，但NaHS對N2A胞突生長的影響不顯著[39]。此外，NaHS作為H2S的常見供體，可選擇性殺傷膠質母細胞瘤細胞(T98G和U87)，同時保留正常人微血管內皮細胞(hCMEC/D3)，對膠質母細胞瘤細胞的殺傷可能是由于ROS的產生增加了損傷誘導的結果，NaHS還能通過調節氧化應激、DNA損傷、線粒體功能障礙之間的相互關系，增強GBM細胞對放射治療的敏感性，間接抑制膠質母細胞瘤細胞生長[40]。

在體內實驗中，Takano等[41]建立了沉默CBS的U87-MG膠質瘤細胞株，并將其種植于SCID小鼠，CBS沉默的亞克隆具有較短的腫瘤潛伏期和更快的腫瘤生長速度。除腫瘤體積增大外，CBS沉默的腫瘤通過增強VEGF、ANGPTL4、HIF2α表達水平，增加了膠質瘤的侵入深度、血管密度、細胞增殖等。可以發現下調CBS的體內實驗結果與結腸癌、胃癌等體內實驗結果相反，這些差異的存在可能與H2S在不同組織來源腫瘤中的基礎表達量以及腫瘤微環境差異有關。

2.7 H2S與其他腫瘤

除結腸癌和乳腺癌等常見惡性腫瘤以外，H2S在口腔癌、食管癌、卵巢癌、尿道上皮癌等其他多種腫瘤中也起到一定的作用。

已有臨床實驗報道在口腔鱗狀細胞癌中較鄰近的良性口腔黏膜中H2S釋放量增多[42]，且口腔黏液表皮樣癌中CBS、CSE以及3-MPST升高，而游離H2S呈升高或輕微升高，進一步說明在惡性腫瘤的維持和生長過程中，對H2S進行了快速的代謝，并且提高內源性H2S濃度可明顯促進口腔癌細胞的生長。

在食管癌EC109中，NaHS(400 μmol/L)持續24 h的供給使內源性H2S濃度升高，但仍處于H2S生理劑量范圍(0.2～1.0 mmol/L)內，并通過HSP90通路促進細胞增殖。此外，NaHS處理使食管癌細胞Bcl-2表達增加，cleaved caspase-3和Bax表達減少，降低了細胞凋亡。重要的是，NaHS處理則同時增加了食管癌細胞MMP-2、VEGF的表達，增強腫瘤遷移能力[43]。

研究表明鈉/鈣交換劑可通過降低細胞內pH值直接參與H2S誘導的卵巢癌等腫瘤細胞凋亡[44]。在卵巢癌細胞系A2780中，細胞內鈣轉運系統可通過內質網應激下調H2S，誘導腫瘤細胞凋亡，發揮抑癌作用[18]。此外，CBS和CSE在卵巢癌中表達較高，通過下調CBS的表達，可顯著抑制卵巢癌細胞系OV202和 A2780的細胞增殖能力，同時可以減少線粒體的呼吸作用，從而抑制ATP的合成，進一步抑制腫瘤的形成。CBS沉默或CBS抑制的另一個重要結果是細胞ROS水平增加，增加了p53表達，而NF-κB表達減少，從而抑制細胞增殖，促進腫瘤凋亡[3]。在移植有A2780/CP-20異種移植瘤的裸鼠中的后續研究結果表明，CBS的沉默導致腫瘤重量和腫瘤結節數量減少，同時減少了癌細胞增殖能力，抑制血管生成[45]。

膀胱尿路上皮細胞癌中H2S及其合成酶活性或蛋白含量升高[46]，NaHS(<200 μmol/L)處理EJ細胞24 h后，促進細胞增殖及遷移，同時抑制細胞凋亡，表現出明顯的促癌效應。但下調CBS、CSE后，可使內源性H2S下降，同時發揮其抑癌效應。此外，H2S及其合成酶的表達高低與膀胱尿路上皮細胞癌的分期、分級有關，選取94例不同分期/分級的尿路上皮癌患者的尿路上皮細胞和標本進行免疫染色，并采用圖像半定量法、蛋白免疫印跡法和硫敏電極法檢測細胞和標本中CBS、CSE和3-MPST的表達水平和活性，結果表明CBS、CSE、3-MPST的蛋白水平和催化活性與人膀胱組織和人尿路上皮癌細胞系惡性程度呈正相關[47]。

3 H2S與腫瘤耐藥

耐藥是惡性腫瘤化療面臨的難點[48]。目前已有多項研究證明H2S在一定程度上參與了腫瘤耐藥性的過程[49]，如H2S供體NAC可通過線粒體代謝促進耐藥的發生和發展，同時還發現H2S在結腸癌對常用化療藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)產生耐藥性過程中發生了穩定的變化[50]，半胱氨酸在腫瘤中的主要作用是促進H2S的生成，使卵巢癌適應缺氧情況，進而擺脫卡鉑對腫瘤細胞的細胞毒性而引起耐藥[51]。因而下調H2S增強了多種腫瘤對化療藥物的敏感性，用AOAA或CBS的si-RNA敲減CBS時，與順鉑聯用后顯著降低線粒體DNA的修復效率，增強化療藥物對腫瘤的殺傷作用，能明顯增強乳腺癌、肺癌、尿道上皮癌等對順鉑的敏感性[52]。同時運用PAG或CSE siRNA敲減CSE后，還可增強多柔比星對胰腺癌、結直腸癌、肝癌等的殺傷作用[53]。此外，在裸鼠原位異種移植HCT 116模型中，AOAA與奧沙利鉑的抗腫瘤轉移作用有協同作用[24]。

4 總結及展望

H2S調控腫瘤的發生發展主要通過對增殖和細胞周期的調控，協調凋亡和抗凋亡水平，調控血管生成來影響遷移、侵襲，從而表現促進腫瘤生長和發揮抑癌效應的雙向效應，其作用機制主要為通過激活NF-κB通路和 EGFR/ ERK1/2以及COX-2通路發揮促癌作用，又可通過激活某些信號通路如p38 MAPK/PTEN/AKT等發揮抗癌能力[43]。H2S的毒性和治療價值主要取決于濃度，低濃度的H2S起生理作用，高濃度的H2S則可因細胞毒性導致死亡[54]。因為較低濃度的內源性H2S可促進癌細胞生長，因此，用一種選擇性靶向癌細胞H2S的小分子來降低內源性H2S水平是一種有吸引力的治療癌癥的策略[55]。針對較高濃度的內源性H2S能抑制腫瘤的發展，目前有較多學者開始關注緩慢釋放H2S的供體作為新型抗腫瘤藥物的轉化研究。一些通過生成H2S或激活H2S產生酶而發揮藥理學功能的藥物(如: ATB-429、ATB-346、GYY4137 及SPRC 等)相繼誕生，并逐步嘗試運用到腫瘤治療中。H2S參與了多種惡性腫瘤的調節，為開發新的抗癌藥物提供了新的契機，此外，仍有諸多因素制約著基于H2S的藥物開發研究，如供體代表性不足：供體NaHS雖是H2S的最常見研究供體，但當NaHS溶解時，H2S瞬間一次性釋放，實驗結果能否反映H2S的持續作用效應仍有待考量，因此，亟待開發持續穩定的新型供體；此外，作用靶點機制不清：目前H2S在不同腫瘤中的作用機制各有不同，是否存在共有的信號調控途徑尚待明確，以更好地發揮其抗腫瘤作用。隨著H2S在腫瘤中的作用機制逐漸清晰，H2S介導的腫瘤防治有著廣闊的應用前景。