基于多重數據庫的腎癌轉移相關基因生物信息分析及功能初探

張金虎，周洋，王誠悅，鄒元章，汪浩洋，盧俅，孫浩

(江蘇大學附屬醫院泌尿外科，江蘇 鎮江 212013)

腎細胞癌是一種起源于腎上皮的癌癥，占所有腎惡性腫瘤的90%以上[1]。腎癌對放療和化療均不敏感，對于早期腎癌，手術切除腫瘤是目前治療局限性腎癌最有效的方法，但是有近1/3腎癌患者在確診時已經發生遠處轉移，即使接受了手術治療，仍有30%患者出現腫瘤復發或轉移[2]。腎癌轉移的基礎機制仍然不完全清楚。生物信息學可幫助研究者快速、大量和高效地獲取基因組信息和基因表達譜改變等。本研究擬通過生物信息學技術，探討腎癌轉移瘤及原發性腎癌基因表達的差異，找出關鍵的差異基因及其潛在的分子調控機制，并預測其所涉及的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

微陣列數據Gene Expression Omnibus(GEO，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)是數據存儲的公共存儲庫，選取GSE85258芯片數據集，該芯片包含16例腎癌轉移瘤患者血樣品和15例原發性腎癌患者血樣品。腎癌769-P細胞株(美國ATCC細胞公司)；RPMI 1640培養基、細胞培養皿購自生工生物工程(上海)股份有限公司；胎牛血清、Lipofectamine 2000試劑盒(美國Thermo公司)；siRNA-表面活性蛋白A2(SFTPA2)、siRNA-空購于吉瑪基因公司(上海)；侵襲小室(直徑6.5 mm，厚8.0 μm)購于南京福麥斯生物技術有限公司；細胞培養箱(HeraceⅡ 150i)、倒置顯微鏡(conic)、熒光正置顯微鏡(BX51)等由江蘇大學附屬醫院中心實驗室提供。

1.2 在線數據庫分析

1.2.1 登錄網站 登錄GCBI(http:∥www.gcbi.com.cn/)網站，注冊賬號，點擊分析實驗室，創建實驗室。

1.2.2 選擇需要的模塊 本研究選擇樣本分組1、樣本分組2、差異分析、生物功能(GO)分析、信號通路(Pathway)分析、交集、基因相互作用、共表達、通路關系9個模塊。

1.2.3 設置模塊參數 差異分析(P<0.05，差異倍數>1.2倍，數量3 000)；GO分析、Pathway分析(P<0.05)。

1.2.3 設計流程圖應用箭頭將上述模塊按照(樣本分組1、樣本分組2)—差異分析—(GO分析、Pathway分析)—交集—(基因相互作用、共表達)連接起來，使之成為一套完整的流程。

1.2.4 數據庫在線分析 將16例實驗組數據引入樣本分組1，15例對照組數據引入樣本分組2。點擊分析，約30 min分析完畢，查看分析結果。

1.3 細胞實驗

1.3.1 細胞培養及分組 將腎癌769-P細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，置5%CO237℃恒溫箱中培養，24 h換液1次，當細胞長到80%～90%進行消化傳代。細胞分2組：轉染siRNA-SFTPA2抑制769-P細胞表達SFTPA2作為實驗組，轉染siRNA-空不抑制769-P表達SFTPA2作為對照組。

1.3.2 細胞轉染 取對數生長期769-P細胞株，以2×105/mL密度接種于6孔板，培養過夜；細胞饑餓2 h，按照Lipofectamine 2000說明書將siRNA-SFTPA2和siRNA-空分別加入到769-P細胞培養皿中；次日換為普通培養基。

1.3.3 細胞侵襲實驗 消化轉染后的細胞，2 500 r/min常溫離心4 min，取細胞沉淀。用無胎牛血清RPMI 1640培養基重懸細胞，計數板顯微鏡下計數。取10 000個細胞，上室中加入500 μL無胎牛血清RPMI 1640培養基，下室加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，放置5%CO237 ℃培養箱中培養24 h；甲醇固定小室下室面細胞；結晶紫染色30 min；用PBS將小室洗凈；晾干小室；用熒光正置顯微鏡(100倍)觀察兩組小室下室面細胞，各選取5個不同視野計數細胞。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 人腎癌轉移瘤和人原發性腎癌差異基因的篩選結果

將篩選出的3 000個差異基因按差異倍數和q值進行排序并選出差異最大的10個升高基因(表1)和10個降低基因(表2)。SFTPA2升高最顯著，溶質載體家族17成員3(SLC17A3)降低最明顯。

2.2 GO分析和Pathway分析結果

GO分析發現，3 000個差異基因與350個生物功能有關，選10個最顯著的生物功能(表3)。Pathway分析結果顯示，3 000個差異基因與128條信號通路有關，挑出10條最顯著的信號通路(表4)。

表1 升高顯著的差異基因

表2 降低顯著的差異基因

表3 差異基因GO分析

表4 差異基因Pathway分析

2.3 差異基因間相互作用結果

篩選3 000個差異基因中與上述350個生物功能有關且與128條信號通路有關的基因，得到523個基因。構建基因網絡，發現523個差異基因中存在441條相互作用關系，有260個節點。選取信號傳遞中介能力最大的10個基因作圖。結果絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)的信號傳遞中介能力最大，其可能是基因網絡的中心環節，且與蛋白激酶C(PRKCA)、原癌基因(NRAS)、一氧化氮合酶1(NOS1)存在直接聯系(圖1)。

2.4 差異基因共表達結果

研究發現，523個差異基因中存在571條共表達關系，共有169個節點，其中有正相關也有負相關，選取10個與周圍基因關系數量最多的基因構圖，發現10個基因間共表達互為正相關(圖2)。

箭頭方向表示上下游，無箭頭表示兩個基因形成復合物發揮協同作用，實線表示直接作用，虛線表示間接作用

圖1 差異基因間相互作用

實線表示正相關

2.5 信號通路網絡分析結果

將與3 000個差異基因有關的128條信號通路作網絡分析，結果顯示，其中存在156條關系，有54個節點。選取10個上下游通路最多的信號通路，發現MAPK信號通路為上下游通路最多的信號通路，其可能是這些差異基因的核心信號通路(圖3)。

箭頭方向表示上下游

2.6 侵襲實驗結果

細胞侵襲實驗結果顯示，實驗組腎癌細胞侵襲細胞數明顯小于對照組(t=18.44，P<0.01)，由此可以初步認為抑制腎癌769-P細胞SFTPA2表達可降低其侵襲能力(圖4)。

圖4 侵襲實驗結果

3 討論

在GSE85258數據集中對實驗組與對照組進行差異基因篩選，共得到3 000個差異基因。既往研究認為SFTPA2和纖維化及第三類致死率較高的遺傳性肺纖維化有相關性，研究表明SFTPA2與腎纖維化也有關[3]。此外，有研究發現SFTPA2 參與編碼人表面活性蛋白[4]，可能與肺癌有關[5]。本研究發現的差異基因中，SFTPA2升高最明顯，提示SFTPA2高表達可能對腎癌的轉移和進展起關鍵作用。

本研究發現差異基因GO分析最顯著的生物功能是依賴DNA轉錄，Pathway分析最顯著的是內質網蛋白質加工，因此可初步認為差異基因可能通過影響依賴DNA轉錄和內質網蛋白質加工，從而影響腎癌的轉移。而差異基因共表達網絡圖中基因之間的表達有正相關也有負相關，故基因間具體的表達關系及對腎癌發生轉移的影響，尚需進一步研究。

在構建基因網絡中，發現MAPK1信號傳遞中介能力最大，且其與PRKCA、NRAS、NOS1存在直接聯系。研究顯示，MAPK1是調控胃癌細胞增殖和遷移的直接功能靶點[6]。另有研究發現MAPK1與肝內膽管癌、肝細胞癌有關[7-8]。Guo等[9]發現，PRKCA與食管炎的惡變呈正相關；Zhu等[10]發現，NOS1抑制鼻咽癌細胞的自噬。因此，MAPK1、PRKCA、NOS1與腫瘤的發生發展存在相關性。且目前尚不能排除NRAS與腫瘤無關。故推斷，MAPK1、PRKCA、NRAS、NOS1異常表達可能與腎癌發生轉移存在一定的相關性。

信號通路網絡分析發現，MAPK信號通路是上下游通路最多的信號通路。研究表明有基因通過靶向MAPK信號通路增強腎癌細胞活力、侵襲性和進展[11-13]。在MAPK信號通路上下游中，包含細胞周期、細胞凋亡、P53信號通路、癌癥途徑等與腫瘤發生發展密切相關的信號通路。因此推斷，上述通路與腎癌轉移具有相關性。

選取表達差異最顯著的基因行體外細胞實驗，結果顯示抑制SFTPA2表達可降低腎癌細胞侵襲能力。由此可初步推測SFTPA2異常表達與腎癌轉移有一定的關系。但本研究只進行了細胞侵襲實驗，細胞增殖實驗和細胞凋亡實驗及其他相關實驗待后續完善，以期進一步了解SFTPA2在腎癌細胞中的功能。

綜上所述，本研究在腎癌轉移瘤患者血中發現3 000個差異基因，表達異常的基因可能通過復雜的基因調控網絡，參與MAPK信號通路等，促進腎癌發生轉移。