p38絲裂原活化蛋白激酶通路在重癥急性胰腺炎中的作用

李海濤 張曉蘭 陳曉燕 李達周 王蓉 江傳燊 王雯

1解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院消化內科，福州 350025；2福建醫科大學福總臨床醫學院，福州 350025；3廈門大學附屬東方醫院，福州 350025

【提要】 將60只雄性SD大鼠分為對照組、急性壞死性胰腺炎(ANP)組、p38MAPK信號通路特異性抑制劑SB203580干預組。結果顯示，干預組大鼠胰腺病理損傷較ANP組顯著減輕，p38MAPKmRNA及蛋白表達顯著下調，TNF-α表達也顯著下調。表明p38MAPK在ANP中發揮重要作用，抑制其表達可有效改善ANP的嚴重程度。

在重癥監護室住院超過2周的重癥急性胰腺炎(SAP)患者中，有多達25%的患者會出現嚴重的并發癥或病死[1]。因胰腺的炎癥反應受到酶介導的細胞損傷的調節，導致胰腺自身消化，釋放大量炎癥因子，引起全身炎癥反應綜合征(SIRS)[2]。細胞因子產生的一個密切相關的機制是蛋白激酶的激活[3- 4]。已有研究發現，p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPKs)在SAP發病機制中扮演了重要角色。磷酸化的p38MAPK (p-p38MAPK)是活化巨噬細胞的重要促炎成分[5]。p38 MAPK磷酸化先于核轉錄因子-κB(NF-κB)，而抑制p38 MAPK可以阻斷NF-κB磷酸化[6]，進而抑制炎細胞因子(IL-1、IL-6)的釋放，改善SAP的癥狀[7]。本研究通過制備大鼠急性壞死性胰腺炎(acute necrotining pancretitis, ANP)模型，觀察p38MAPK信號通路特異性抑制干預后p38MAPK蛋白表達及TNF- α水平的變化，探討p38MAPK信號通路在ANP發病機制中的作用。

一、材料與方法

1．實驗動物及分組：清潔級雄性SD大鼠60只，體重250～300 g，購自重慶醫科大學動物研究中心。在特定的無致病性條件下飼養，并提供足夠的無菌水和食物。60只大鼠隨機分為對照組、ANP組、p38MAPK信號通路特異性抑制SB203580干預組(干預組)，每組20只。建立模型之前，斷絕大鼠食物12 h，正常提供飲水。參照文獻[8]采用膽胰管逆行注射牛磺膽酸鹽1.5 ml/kg方法構建ANP大鼠模型。干預組在制模前2 h尾靜脈注射9.5 mg/kg的SB203580。對照組未做任何處理。制模后12、24 h分兩批各處死10只大鼠，取胰腺組織，部分液氮冷凍，部分甲醛固定。

2．胰腺組織病理學檢查：取造模12 h后固定的胰腺組織，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色。由3位病理醫師盲法讀片，對腺泡細胞壞死、間質炎癥、水腫和出血程度進行評分[9]。壞死：無壞死為0分，壞死面積<5%為1分，5%～<20%為2分，>20%為3分；炎癥：無炎癥為0分，輕度炎癥為1分，中度炎癥為2分，重度炎癥為3分；水腫：無或者極少為0分，小葉間隙水腫為1分，小葉內水腫為2分，胰島呈孤立島狀為3分；實質性出血：無出血為0分，輕度出血為1分，中度出血為2分，重度出血為3分。總分最高為12分。

3．p38MAPK mRNA 表達檢測：取冷凍胰腺組織，采用Trizol試劑提取組織總RNA，應用分光光度計法分析RNA的純度及濃度。采用qRT-PCR檢測組織p38MAPK mRNA 表達。先逆轉錄cDNA，RevertAid Reverse Transcriptase試劑盒購自美國Thermo公司，按說明書操作。再行PCR擴增。引物由上海生工生物工程有限公司合成。p38MAPK正向引物5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′，反向引物5′-GAGCCAGTCCAAAATCCA-3′，β-actin正向引物5′-TCCTCCTGAGCGCAAGTACTCT-3′，反應引物5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′。引物序列均由Takara公司合成。PCR反應條件：94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環，最后72℃延伸10 min。以公式2-△△CT計算mRNA相對表達量。

4．p38MAPK蛋白表達檢測：取冷凍胰腺組織，在10 mmol/L Hepes緩沖液(pH 7.5)中研磨，500 g離心去除細胞碎片，15 000 g離心后收集上清，采用Bradford法定量蛋白。取40 μg蛋白，常規行蛋白質印跡法檢測p38MAPK蛋白表達。其中兔抗大鼠p38MAPK抗體購自Caymann Chemical公司，工作濃度1∶100，HRP標記小鼠抗兔IgG購自Immune Chemical公司，工作濃度1∶20。由Fluorchem FC2 型熒光劑凝膠成像系統獲取條帶灰度值，以目標條帶與內參β- actin條帶灰度值比表示蛋白相對表達量。

5．ELISA法檢測TNF-α水平：取上述胰腺組織上清，采用ELISA法檢測上清中TNF-α水平。ELASA試劑盒(Catalog#KRC 3013)購自Biosource公司，按說明書操作，每個樣本設3個復孔。上酶標儀測各孔在波長450 nm處的吸光值(A450值)。繪制標準曲線，計算各樣本的TNF-α水平，取均值。

二、結果

1．胰腺病理形態改變及病理評分：對照組大鼠胰腺組織無明顯病理改變；造模24 h后ANP組大鼠出現血性腹水，鏡下見胰腺水腫、壞死和炎癥細胞浸潤；干預組胰腺組織病理學變化較ANP組顯著減輕(圖1)。 對照組大鼠胰腺病理評分為0分，ANP組24、48 h胰腺病理評分分別為(3.6±0.04)、(3.7±0.02)分，干預組分別為(0.23±0.01)、(0.38±0.07)分。SB203580干預后病理損傷顯著減輕(P值均<0.05)。

注：ANP為急性壞死性胰腺炎

圖1對照組(1A)、ANP組(1B)、干預組(1C)大鼠的胰腺組織病理改變(HE ×200)

2．胰腺組織p38MAPK mRNA、蛋白表達量變化：12 h時對照組、ANP組、干預組大鼠胰腺組織p38MAPKmRNA表達量分別為1.00±0.09、2.36±0.12、1.84±0.14，24 h時分別為0.98±0.08、2.58±0.09、1.60±0.08；12 h時對照組、ANP組、干預組大鼠胰腺組織p38MAPK蛋白表達量分別為0.28±0.04、0.65±0.08、0.37±0.03，24 h時分別為0.25±0.04、0.63±0.07、0.34±0.02(圖2)。ANP組大鼠胰腺組織p38MAPKmRNA及蛋白表達量均顯著高于對照組，干預組顯著低于ANP組，但仍顯著高于對照組，差異均有統計學意義(t值分別為28.67、42.02，8.92、25.74，15.96、17.33；13.08、14.91，10.36、12.60，5.69、6.36。P值均<0.05)。

3．胰腺組織TNF-α水平的變化：對照組大鼠胰腺組織12、24 h的TNF-α水平分別為(33.43±7.12)、(36.03±2.19)ng/L，ANP組分別為(180.38±13.42)、(220.65±18.42)ng/L，干預組分別為(110.51±12.22)、(150.29±9.22)ng/L。ANP組大鼠胰腺組織TNF- α水平顯著高于對照組，干預組顯著低于ANP組，但仍顯著高于對照組，差異均有統計學意義(t值分別為30.98、38.20，11.38、10.39，17.34，19.23。P值均<0.05)。

注：ANP為急性壞死性胰腺炎

圖2對照組、ANP組、干預組大鼠12(1～3)、24(4～6) h時胰腺組織p38MAPK蛋白表達量

討論急性胰腺炎(AP)的早期事件包括非感染性的急性炎癥階段。細菌進入胰腺組織，并由此產生繼發性炎癥是隨后發生的事件。胰腺實質內產生促炎細胞因子最早發生在AP發生的前30 min內[10]。早期產生的促炎細胞因子，如TNF-α和IL-1β，導致局部炎癥遞質的急劇上升，這些遞質進入循環系統，使機體處于一個超炎癥狀態[11]。因此，無論何種誘因，胰腺內最初的局部器官特異性急性炎癥都會轉化為以多器官功能障礙為特征的全身性疾病。炎癥性遞質，尤其是細胞因子，在這個過程中起著重要作用。

近年來，p38MAPK通路在AP發病機制中的作用受到廣泛關注[12]。盡管有研究表明，雨蛙肽誘導的大鼠AP實驗中，抑制p38MAPK會進一步加重病癥，提示p38MAPK可能在該模型中起保護作用，而不是有害作用[13]，但大多數研究則認為p38MAPK激活加重AP。在雨蛙肽誘導的急性水腫性胰腺炎和CDE飲食誘導的小鼠ANP中，給予p38MAPK抑制劑CNI-1493可以有效改善胰腺壞死、高淀粉酶血癥、高脂血癥，并上調TNF-α基因表達[14]。p38MAPK還可通過G蛋白耦聯受體被激活，并通過激活核轉錄因子ATF-2、NF-κB等在轉錄水平誘導促炎癥細胞因子TNF-α等產生[15]。本研究結果顯示，在ANP大鼠模型中，給予SB203580干預可以有效抑制p38MAPK表達，下調TNF-α表達，減輕胰腺病理損傷程度，為p38MAPK抑制劑臨床應用于SAP的治療提供實驗依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突