經皮瘤內注射腎上腺素／順鉑對小鼠肝癌的抑制效果

江萍 王欣玥 王立峰 劉寶瑞 李茹恬

近年來，肝癌的發病率一直在增加，已成為第5 種 最常見的癌癥類型（占癌癥病人總數的54%），目前居癌癥死亡原因的第2 位，5 年生存率為15%～17%［1-4］；手術是肝癌治療的主要方式，但很多老年病人在確診時已失去手術機會，僅10%～15%的病人可以接受手術治療［5-8］。 在肝癌的治療領域，靶向治療藥物和免疫卡控點治療雖可改善預后，但新藥往往價格昂貴，限制了其在晚期肝癌病人中的應用［9-10］；另一方面，由于肝癌血供豐富，肝癌的局部治療一直是肝癌治療的重要組成部分，應用也日益廣泛，包括射頻消融（adiofrequencyablation，RFA ） 、微波消融（microwave ablation，WMA） 、無水酒精注射治療（percutaneous ethanol injection，PEI） 和冷凍消融（cryoablation），肝動脈栓塞化療術（transarterial chemoembolization，TACE） ，外放射治療（ external beam radiotherapy，EBRT） 和內放射治療［11-12］；對不能切除的肝癌，采用超聲或CT 引導下藥物瘤體內注射［13］，具有操作簡單， 不良反應少、損傷小及療效好等特點。 但是，化療藥物有一定的不良反應， 不能無限量增加使用量，療效不是很理想。 因此，提高腫瘤組織的化療藥物灌注量， 增加療效， 減少化療藥物對周圍正常組織的損害， 值得我們進一步研究。 鉑類藥物在過去的30 年廣泛用于肝癌的治療［14］，腎上腺素（Adr）已被證明可以增加腫瘤內順鉑（DDP）的濃度從而增加抗腫瘤作用［15］。 由于Adr 價格低廉，在臨床上長期應用，被證明是安全可靠的，實用性強，性價比高。 本實驗研究旨在證實Adr 和DDP在肝癌治療上具有的協同效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及瘤株：清潔級ICR（institute of cancer research）小鼠（n＝20），6～8 周齡，雌雄各半，體質量18～22 g，由南京大學醫學院附屬鼓樓醫院實驗動物中心提供；肝癌組織來源小鼠H22 肝癌細胞株，ICR 小鼠腹腔傳代，由南京大學腫瘤研究中心提供。

1.1.2 主要試劑：Adr 由江西億博藥物有限公司提供；DDP 由山東鉑源化學有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 建立鼠H22 細胞系動物模型：小鼠H22 肝癌細胞株，ICR 小鼠腹腔傳代，無菌條件下抽取腹腔保種7～9 d 生長旺盛的H22 細胞，用生理鹽水稀釋成2×106／mL的細胞。 每只小鼠于左腋皮下接種瘤細胞懸液0.2 mL。 制備荷瘤ICR 鼠20 只，腫瘤接種完成后每2 d用卡尺測定腫瘤體積。 接種后7 d，腫瘤長徑約6 mm 時，將小鼠隨機分為4 組，每組5 只。 分組如下：對照組，Adr 組， DDP 組，Adr＋DDP 組。

1.2.2 給藥方法：使用滅菌注射用水配制DDP 及Adr，瘤內注射。 對照組：滅菌注射用水0.2 mL／只；Adr 組：Adr 5 mg／kg，0.2 mL／只，瘤內注射；DDP 組：DDP 5 mg／kg，0.2 mL／只，瘤內注射；DDP ＋Adr 組：DDP 5 mg／kg＋Adr 5 mg／kg，0.2 mL／只，瘤內注射；所有小鼠均只注射1 次，觀察15 d 后處死小鼠。

1.2.3 以脫頸椎法處死小鼠，完整剝離瘤組織，稱重、測量體積后立即于福爾馬林溶液中固定；取固定好的組織做石蠟切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。

1.3 觀察指標

1.3.1 腫瘤體積：分組給藥后隔日用游標卡尺測量腫瘤的長徑a 及短徑b，按公式：瘤體積（V）＝a × b2／2計算移植瘤體積，同時計算每組平均值，繪制移植瘤生長曲線。 計算抑瘤率（IR）＝ （1-治療組體積／對照組體積） × 100%。

1.3.2 聯合用藥效應：評價兩藥合用在體內是否有協同作用，本文參照金氏公式［16］判斷：Q＝E（a＋b）／（Ea＋Eb-Ea×Eb）。 其中E（a＋b）為兩藥合用的抑制率；Ea、Eb 分別為兩藥單用時各自的抑制率。 式中分子代表“實測合并效應”，分母代表“期望合并效應”。 Q ＜0.55 為明顯拮抗（--），Q ＝0.55 ～0.85 為拮抗（-），Q＝0.85～1.15 為單純相加（＋），Q ＝1.15 ～2.0 為增強（＋＋）。

1.4 統計學方法 采用SPSS 21.0 軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗或方差分析（F檢驗），以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對H22 肝癌移植瘤生長體積的影響 Adr 組的IR 為86.69%，與對照組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。 DDP 組的IR 為84.11%；Adr＋DDP 組IR 為93.26%，2 組對抑制腫瘤均有一定的增強作用，但差異無統計學意義（P＝0.060）；根據金式公式計算發現，Adr 與DDP 具有相加作用（Q ＝0.95），表明Adr 與DDP 聯合用藥后對DDP 抑制H22 肝癌的生長有增強作用。 見表1，表2。

2.2 移植瘤組織病理學觀察

2.2.1 大體：移植瘤呈圓形、橢圓形或分葉狀生長，質韌，切面灰白，大部分與周圍組織分界清楚；

2.2.2 光鏡：移植瘤細胞形狀不規則，大小不均一，核大濃染，核異形性明顯。 可見病理性核分裂象，核漿比例明顯增大，可見組織壞死區；各組移植瘤組織病理切片HE 染色見圖1。

表1 各組抑制H22 肝癌移植瘤生長作用的比較（±s，cm3，n＝5）

表1 各組抑制H22 肝癌移植瘤生長作用的比較（±s，cm3，n＝5）

時間 對照組 Adr 組 DDP 組 Adr＋DDP 組第1 天 0.12±0.01 0.12±0.04 0.10±0.02 0.14±0.07第3 天 0.27±0.13 0.08±0.04 0.16±0.09 0.12±0.03第5 天 0.48±0.31 0.13±0.04 0.21±0.09 0.12±0.04第7 天 1.17±1.03 0.19±0.06 0.35±0.29 0.18±0.02第9 天 1.73±1.48 0.20±0.19 0.70±0.86 0.19±0.11第11 天 3.36±1.76 0.44±0.48 0.73±0.70 0.22±0.12第13 天 4.98±2.08 1.01±1.37 0.70±0.72 0.53±0.27第15 天 6.59±2.56 0.88±0.99 1.05±1.07 0.44±0.16

表2 小鼠H22 肝癌移植瘤第15 天體積以及IR（±s，n＝5）

表2 小鼠H22 肝癌移植瘤第15 天體積以及IR（±s，n＝5）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與DDP 組比較，△P＜0.05

組別 體積（images/BZ_32_2127_335_2149_368.png±s， cm3） IR（%）對照組 6.59±2.56 -Adr 組 0.88±0.99? 84.11 DDP 組 1.05±1.07? 86.69 Adr＋DDP 0.44±0.16?△ 93.26

圖1 各組移植瘤組織病理切片HE 染色（×100）

3 討論

在既往的研究中，α-腎上腺素能刺激引起腸血管系統的血管收縮并降低腹膜毛細血管密度，低劑量的Adr 誘導β2 受體介導的血管舒張，而較高劑量引起血管收縮。 Adr 誘導的血管收縮，使藥物更深地滲透到腫瘤結節中，Adr 與DDP 聯合使用，增加了DDP 在瘤內的濃度［17］，此外Adr 通過減慢通過腫瘤脈管系統的藥物排出和降低間質壓力來增加藥物向腫瘤的擴散［18］、在我們的試驗研究中，Adr 與常規化療藥物DDP 聯用，IR 達到93.26%，與DDP 單藥相比具有優勢。 另外，實驗結果提示單用Adr 對腫瘤生長也有抑制作用，IR 達到86.69%，移植瘤病理HE 染色病理切片提示，單用Adr，腫瘤組織內可見壞死灶，可能是腫瘤周圍血管收縮，導致腫瘤組織血供減少，局部缺血壞死。

Adr 作為臨床最常見的血管活性藥物，其優勢在于收縮血管的作用，而且價格低廉。 本研究著眼于“老藥新用”，將常見的化療藥物DDP 與縮血管藥物Adr 聯合應用，可作為經過反復治療不能耐受全身化療的晚期老年肝癌病人以及無力支付高額靶向治療或免疫治療費用的晚期老年肝癌病人的替代選擇，以期為經濟條件相對較差的晚期老年肝癌病人帶來一定的臨床獲益。 我們的研究結果表明，使用Adr 與化療藥物聯合進行腫瘤的瘤內注射，可提高化療藥物的抗腫瘤效應，減少化療藥物對周圍正常組織的損害， 降低對身體的不良反應，進一步提高其臨床應用價值，值得進一步深入研究及臨床應用探索。