干細胞ECM修復軟骨缺損與鹿茸干細胞ECM的研究進展

王玉俗，褚文輝，李久波，趙全民※，李春義

（1.吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118；2.臺州學院生命科學學院，浙江 臺州 317000；3.長春市農業機械研究院，吉林 長春 130000；4.中國農業科學院特產研究所特種經濟動物分子生物學國家重點實驗室，吉林 長春 130112）

透明軟骨是軟骨的主要類型之一，由軟骨細胞及細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）所構成[1]。關節表面軟骨層軟骨細胞的主要營養來源是關節液，由于內無血管，只能靠細胞基質滲透完成，再加上軟骨細胞缺乏遷移能力，不能聚集到創傷部位，因此，關節表面軟骨損傷后自身修復能力受到極大的限制。在關節滑膜有病變時，如機械損傷導致的骨關節炎，關節軟骨出現破損；類風濕性關節炎，滑液分泌異常失去正常的潤滑作用，摩擦力增大導致軟骨缺損[2]。長期的軟骨缺損使破損面逐步加大，最終的治療方式為人工關節置換。研究表明，美國每年因關節炎接受關節置換手術的患者已經超過140 萬。我國估計每年接受關節置換的患者約為45 萬[3-4]。因此，旨在減少骨性關節炎發生，大量的軟骨修復研究意義重大。

隨著人工合成材料和納米材料的興起，種子細胞結合支架材料為軟骨缺損修復開辟了新時代[5-6]。研究表明，豬軟骨細胞的細胞外基質和聚羥基乙酸（Polyglycolic acids,PGA）支架植入裸鼠皮下可構建軟骨組織。試驗表明，軟骨細胞在ECM 中的增殖，黏多糖（Glycosaminoglycan，GAG）和膠原的沉積明顯高于PGA，且均勻地分布在ECM支架中，PGA支架主要在支架外周區域有沉積[7]。表明ECM 為軟骨形成提供了有利環境。天然支架ECM 具有高組織相容性并且具有保留細胞因子、生長因子和其他功能性蛋白質的潛力。

鹿茸組織是一種骨/軟骨復合物，其軟骨組織中富含血管、多種骨/軟骨生成相關因子[8]，是一種良好的軟骨修復材料。但鹿茸價格昂貴，使用鹿茸組織ECM修復軟骨缺損不是最佳的選擇。李春義等[9]研究表明，鹿茸的發生是由鹿茸干細胞分裂、分化而實現，即生茸區骨膜（Anterogenic periosteum，AP）分化為角柄，再由角柄骨膜（Pedicle periosteum，PP）再生出鹿茸。鹿茸干細胞具有分化出完整的骨、軟骨組織器官的能力，將鹿茸干細胞進行體外培養，收集其分泌的ECM，從理論上，ECM可能是軟骨修復的一個新的天然生物支架材料。本文就軟骨缺陷修復進行綜述，并對使用鹿茸干細胞ECM 修復軟骨缺陷的初步結果進行總結。

1 軟骨的結構特征

軟骨主要作用包括承受力學負荷，關節軟骨能將作用力均勻分布，使承重面擴大，保護關節不易損傷；潤滑作用，關節軟骨表面光滑，因此關節運動時不易磨損[10]兩個方面。軟骨是由軟骨細胞和ECM 組成，其中，ECM約占總體積的98%，其主要由水、蛋白多糖和膠原組成。膠原的主要成分為Ⅱ型膠原，在軟骨內形成網架結構維持形態和硬度[11]。膠原網架結構內由蛋白多糖填充，蛋白多糖中大量帶負電的陰離子如COO-和SO32-相互排斥并吸引陽離子，從而產生滲透壓，使水進入軟骨內[12]。硫酸軟骨素等吸附流動的水產生摩擦阻力，軟骨承受壓力后引起水在多孔固態基質內流動，使水起到承重的作用。軟骨細胞是一種高度分化的細胞，存在于軟骨陷窩，約占總體積的1%[13]。軟骨中軟骨基質蛋白的合成和分泌主要來源于軟骨細胞。成年人的軟骨細胞在正常狀態下不會發生分裂，但當軟骨在受到病理刺激后會發生增殖。膠原纖維與基質共同作用使軟骨具有彈性和張力及強度。膠原纖維類似混凝土中的鋼筋，其他基質類似混凝土中的水泥。由于軟骨具有這種富含基質的組織學特征，軟骨基質受到破壞就意味著軟骨的缺損。

2 間充質干細胞修復軟骨缺損

間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是組織工程方法中常用的細胞。這些細胞具有較高的增殖率和軟骨分化能力，容易從脂肪組織、骨髓和滑膜中收集[14-15]。據報道，植入的干細胞會釋放生長因子、生物活性脂質和細胞因子，這些因子具有促進軟骨再生和抗炎作用[16-18]。常用于治療軟骨缺損的干細胞有骨髓間充質干細胞（BMSCs）和脂肪干細胞（ADSCs）等。

2.1 骨髓間充質干細胞修復軟骨缺損

骨髓間充質干細胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是組織工程中研究最多的干細胞，不同的研究均報道了這些細胞治療軟骨缺損的潛力，并已經在臨床I 期和II 期中得到應用[19]。Wakitani 等[20]在40 名膝關節缺損患者中使用BMSCs 修復，并對患者進行11年的隨訪和觀察，臨床治療效果表明，關節缺損得到修復并且在觀察期間未出現腫瘤或發生感染。證明BMSCs 移植是安全有效的治療方法。Gobbi 等[21]對37 例關節軟骨缺損患者進行治療，其中19 例使用自體軟骨移植治療，18 例使用自體BMSCs 治療。結果表明，5年后自體軟骨移植和BMSCs的治療成功率分別為76%和81%，再生軟骨都為透明軟骨。

2.2 脂肪干細胞修復軟骨缺損

脂肪干細胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）由于其易獲取，并具有與BMSCs 相同的特性，被認為是修復軟骨缺損中BMSCs 的良好替代品[22]。研究表明，ADSCs可產生多種有益的旁分泌因子降低關節軟骨中腫瘤壞死因子（TNF-）和基質金屬蛋白酶（MMP）的產生，增強軟骨保護作用[23-24]。Yong-Gon 等[25]對18 名關節缺損患者關節內注射ADSCs，2年后隨訪發現患者軟骨缺損得到改善、疼痛感減輕和膝關節功能得到改善。

3 ECM修復軟骨缺損

ECM 是活體組織和器官內細胞分泌的細胞外產物，其作為細胞生長的微環境，在細胞黏附、增殖和分化方面都起著重要作用。ECM 主要由膠原蛋白、蛋白聚糖與氨基酸聚糖等多種大分子組成的復雜網絡結構[26-27]。ECM 在不同的組織器官中主要成分含量不同。如膠原蛋白種類眾多，其中Ⅱ型膠原蛋白主要由軟骨細胞產生的，多存在于骨骼、關節、肌腱等組織中，Ⅱ型膠原比Ⅰ、Ⅲ型膠原含有更豐富的羥脯氨酸，更適合對軟骨修復。Wang 等[28]將從兔和大鼠肌腱和尾部獲得的II 型和I 型膠原混合制成支架，并將兔軟骨細胞與兔膠原支架和大鼠膠原支架混合植入經手術創建的缺損兔膝關節軟骨中，結果表明，修復的軟骨細胞均明顯地成簇排列，修復軟骨與鄰近的健康組織整合良好。ECM 具有支持組織形態形成，并且為免疫應答提供場所的功能，其在機體生長發育過程中起到重要作用。ECM 支架具有高組織相容性并且具有保留細胞因子（Cytokine,CK）、生長因子和其他功能性蛋白質的潛力。Schwarz等[29]將軟骨組織脫細胞得到ECM支架后對軟骨缺損處進行修復，結果顯示，ECM 支架在促進新生軟骨基質合成方面具有明顯優勢。豬小腸黏膜下層（Porcine small intestinal submucosa，SIS）-ECM已被用于重建各種組織，并且取得了良好的臨床效果[30]。但目前的組織ECM 制備過程繁瑣，不適合臨床應用。

在抗壞血酸的作用下，干細胞可分泌大量的膠原，形成細胞膜片即ECM。體外試驗證明，軟骨細胞通過細胞培養所得的ECM 支架能夠促進細胞增殖，并且可以促進組織再生[31]。細胞ECM 支架形成的過程通常分三步：第一步，單層培養細胞至80%～90%；第二步，添加抗壞血酸促進ECM沉積；第三步，收集ECM，去細胞化，得到ECM 支架。ECM 支架材料，不但能作為生物支架為細胞的進入提供支撐，而且還保留了原組織中生長因子，移植到活體后組織會做出自然應答。在生物支架材料軟骨修復過程中，一些重要的生長因子，如轉化生長因子（Transforming growth factor,TGF）、成纖維細胞生長因子（Fibroblast growth factor,FGF）和表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）如能保留，可以增強軟骨細胞的功能并促進軟骨細胞再生[26]。Tang 等[32]使用 BMSCs-ECM 對兔膝關節軟骨缺損進行治療，結果表明，ECM 可以使BMSCs 促進缺損部位細胞增殖，在軟骨分化和基質生成中發揮重要作用。因此，干細胞ECM 支架制備不僅簡單，而且可以更好地使細胞附著，有可能成為臨床上具有廣闊前景的軟骨修復材料。

4 鹿茸干細胞ECM的初步研究和應用前景

4.1 鹿茸的再生與鹿茸干細胞

鹿茸作為唯一能夠完全再生的哺乳動物附屬器官，可以作為眾多再生研究的理想模型，同時也為我們揭示自然界哺乳動物復雜器官完全再生的問題提供一個理想的生物模型[33-34]。鹿茸不是直接從鹿頭上長出來的，而是由鹿頭部的角柄生長出來的附屬器官，角柄也不是與生俱來的，是鹿將要進入青春期時才開始萌發，生長到一定高度（梅花鹿、赤鹿為5～6 cm）時，角柄頂端開始出現稀疏的毛發，并具有光澤，預示著初角茸已經開始發生[34]。然后鹿茸出現快速生長并逐漸成熟，再生的鹿茸生長非常快：梅花鹿的速度能達12.5 mm/d，馬鹿的可達27.5 mm/d；秋天到來時，鹿茸逐漸骨化，茸皮脫落，變成骨化的鹿角[35-36]。

組織學研究發現，在鹿角脫落前期，角柄遠端部分變得粗糙，且血管化明顯，可以將死去的鹿角和活組織角柄區分開來。鹿角一旦脫落，角柄殘樁遠端的皮膚隨即生長并向內遷移，逐漸覆蓋角柄斷面。隨即PP 組織也開始增厚，PP細胞分裂繁殖形成2 個新月形的生長中心。一個在前部，形成鹿茸的眉枝，另一個在后部形成鹿茸的主干。其內部是新生的含有血管的軟骨組織，軟骨組織上覆蓋著一層增生的間質細胞[37]。

研究表明，PP 是驅動鹿茸再生的組織基礎；青春期公鹿的額外脊AP組織是角柄和初角茸生成的組織基礎。AP 組織的發現揭示了鹿茸發生的秘密。于是設計試驗將AP 移植到鹿身體的其他部位，如前額可以在移植處形成完整的異位鹿茸，并且擁有和正常鹿茸一樣周期性再生的能力。所以AP 組織是角柄和初角茸發生的關鍵組織[38]。

基于 AP 和 PP 的獨特性，Li 等[39]對這 2 種細胞做了進一步研究，發現這2 種細胞都表達了胚胎干細胞標記物Oct4、Sox2、Nanog、CD9。離體條件下可以誘導分化成軟骨細胞、成骨細胞和神經元細胞。確定AP 與PP 細胞都是鹿茸干細胞，AP 細胞（APC）是鹿茸發生的干細胞，PP細胞（PPC）是鹿茸再生的干細胞。

4.2 鹿茸干細胞ECM在修復軟骨缺損中的初步研究

我們用大鼠進行關節軟骨缺損修復試驗研究，將大鼠膝關節造成直徑2 mm、深2 mm 的軟骨缺損，然后隨機分為實驗和對照2 個組，對照組大鼠不進行任何治療，實驗組將APC-ECM 填充到軟骨缺損處。12周后分別取樣做組織染色觀察，所得結果如圖1 所示，12周時對照組沒有出現軟骨修復的跡象，缺損處明顯，軟骨下骨由纖維組織填充修復；實驗組APC-ECM 中有軟骨細胞產生，缺損部分修復的軟骨和邊緣的正常軟骨結合良好，修復的軟骨厚度與正常軟骨厚度一樣，表面光滑平整，軟骨下骨修復與正常軟骨相似。

圖1 手術后12 周大鼠關節軟骨缺損修復Fig.1 Repairation of articular cartilage defect in rats 12 W after operation

4.3 鹿茸干細胞ECM應用前景

鹿茸中富含各種促進骨/軟骨生長的細胞因子和功能蛋白。胰島素樣生長因子（Insulin-like growth factor，IGF）是一類鹿茸軟骨生長調控因子。鹿茸頂端非骨化區富含IGF受體，并且從上至下mRNA的表達量逐漸減少[40]。TGF 在鹿茸骨膜細胞向成骨細胞轉化、細胞外基質合成以及形成新骨等方面具有明顯的促進作用[41-42]。在各種細胞因子和功能蛋白的作用下，鹿茸干細胞分裂，分化生成完整的鹿茸組織。使用鹿茸干細胞作為種子細胞培養分泌的ECM 其中保留大量的促進軟骨生長的細胞因子，為軟骨修復提供了一個新的可能性。

5 展望

使用干細胞修復軟骨缺損的想法早有提出并已實施，但將鹿茸干細胞用于修復軟骨缺損的研究鮮有報道。經過我們的研究已經初步證明鹿茸干細胞 ECM修復軟骨缺損的效果良好。鹿茸干細胞有衍生出完整鹿茸的能力，其可以分泌大量的促進軟骨生長的細胞因子和功能蛋白。通過培養誘導鹿茸干細胞分泌ECM保留其中促軟骨生長的細胞因子和功能蛋白，并且有效避免病原體傳播、炎癥等免疫反應的風險，將為軟骨修復提供參考。