HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地、生長(zhǎng)年限、采收期的京大戟和甘遂中大戟二烯醇含量

馮雪梅，畢楚遙，許冰，孟勤

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院天然藥化教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)，吉大一院放射科，吉林 長(zhǎng)春 130021；3.吉林大學(xué)藥學(xué)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，吉林 長(zhǎng)春 130021）

京大戟為大戟科植物大戟（Euphorbia pekinensis Rupr.）的干燥根，主要分布在我國(guó)江蘇、四川、江西、廣西等省區(qū)，秋末或春初采挖。已報(bào)道的京大戟中含有大戟苷、大戟酸、三萜醇、有機(jī)酸、鞣質(zhì)、樹(shù)脂膠、糖等[1]。其中，大戟二烯醇首次寫入2015 版《中國(guó)藥典》[2]，作為京大戟質(zhì)量評(píng)價(jià)的有效成分。近年來(lái)，由于京大戟具有毒性，導(dǎo)致國(guó)內(nèi)外主要針對(duì)于京大戟的藥理毒理進(jìn)行研究，較少涉及對(duì)不同產(chǎn)地不同采收期大戟二烯醇含量變化的研究，質(zhì)量分析評(píng)價(jià)不是很完整。甘遂為大戟科植物甘遂（Euphorbia kansui T.N.Liou ex T.P.Wang）的干燥塊根，主要分布于甘肅、山西、陜西、寧夏、河南等省區(qū)，春季開(kāi)花前或秋季枯苗后采挖。京大戟和甘遂均具瀉水逐飲，消腫散結(jié)之功效，且均以大戟二烯醇作為藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量檢測(cè)的成分。藥典規(guī)定京大戟中大戟二烯醇含量不少于0.60%；甘遂中大戟二烯醇含量不少于0.12%。為了控制質(zhì)量，確保療效，采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)大戟二烯醇進(jìn)行含量測(cè)定[3-9]。為此，本試驗(yàn)采集了不同產(chǎn)地的18 批次京大戟和甘遂藥材，江蘇省基地不同生長(zhǎng)年限、不同采收期的京大戟和山西省基地不同生長(zhǎng)年限、不同采收期的甘遂藥材進(jìn)行大戟二烯醇的含量測(cè)定分析，為確定京大戟和甘遂最佳的產(chǎn)地、最佳生長(zhǎng)年限和采收期提供數(shù)據(jù)支持，為進(jìn)一步擴(kuò)大開(kāi)發(fā)和利用京大戟和甘遂資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Series Ⅲ 雙泵高效液相色譜儀（美國(guó)SSI公司）；KQ-250DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BT125D電子天平（0.01 mg，德國(guó)賽得利斯公司）。

1.2 試劑

大戟二烯醇對(duì)照品系吉林大學(xué)藥學(xué)院天然藥化教研室自制（歸一化法測(cè)定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.00%）；甲醇、乙醇皆為分析純（北京化工廠）；乙腈為色譜純（上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆凰疄橥薰儍羲?/p>

1.3 試材

京大戟藥材，購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)孟勤教授鑒定為京大戟（E.pekinensis Rupr.）的干燥根；甘遂藥材，購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)孟勤教授鑒定為甘遂（E.kansui T.N.Liou ex T.P.Wang）的干燥塊根。2 種藥材均粉碎過(guò)60 目篩，混合均勻，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Venusil XBP C18 柱（4.6 mm 250 mm，5m）；流動(dòng)相系統(tǒng)：乙腈-水（92∶8）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。在此色譜條件下，大戟二烯醇對(duì)照品溶液及供試品溶液在210 nm 處色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 大戟二烯醇對(duì)照品（a）和京大戟（b）的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of euphol reference(a)and Euphorbia pekinensis(b)

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取大戟二烯醇對(duì)照品2.10 mg，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解，定容，制成大戟二烯醇對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取藥材粉末2 g，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入乙酸乙酯25 mL，密塞，精密稱重。超聲提取30 min，冷卻至室溫，精密稱重，用乙酸乙酯補(bǔ)足減失的重量，搖勻后過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，過(guò)0.45m微孔濾膜，即得供試品溶液，備用。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 分別精密吸取大戟二烯醇對(duì)照品溶液 2、6、10、15、20、25L，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，以大戟二烯醇進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出線性回歸方程為Y=456628X 302740（r=0.9991），表明大戟二烯醇對(duì)照品進(jìn)樣量在0.42～5.25g與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積，計(jì)算得大戟二烯醇含量的RSD為0.97%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取6 份藥材粉末各2.0 g，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算得大戟二烯醇的平均含量為0.683%，RSD值為1.40%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別于 0、2、4、8、12、24 h 按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD 值為0.44%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一已知含量的6份京大戟藥材粉末各0.25 g，分別加入大戟二烯醇對(duì)照品1.525 mg，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，精密吸取供試液10L，在“2.1”項(xiàng)下的色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得大戟二烯醇的平均回收率為99.97%，RSD為1.06%（表1），表明該測(cè)定方法加樣回收率良好。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of recovery test

2.4 不同產(chǎn)地京大戟和甘遂中大戟二烯的含量測(cè)定

取6個(gè)不同產(chǎn)地共計(jì)18批次供試樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算大戟二烯醇含量。從表2 可以看出，不同產(chǎn)地的藥材中大戟二烯醇含量存在較大差異。以江蘇產(chǎn)的京大戟中大戟二烯醇含量最高，廣西產(chǎn)的大戟二烯醇含量最低且未達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)；以山西產(chǎn)的甘遂中大戟二烯醇含量最高，以陜西產(chǎn)的大戟二烯醇含量最低。

表2 不同產(chǎn)地樣品中大戟二烯醇含量Table 2 Euphordienol content in samples from different origins

2.5 不同生長(zhǎng)年限京大戟和甘遂中大戟二烯醇含量比較

取不同生長(zhǎng)年限的京大戟和甘遂供試樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算大戟二烯醇含量。從表3 可以看出，不同生長(zhǎng)年限的藥材中大戟二烯醇含量存在差異。比較2、3、4年生的藥材中大戟二烯醇含量發(fā)現(xiàn)，3年生京大戟中大戟二烯醇含量最高，4年生京大戟中大戟二烯醇含量最低；2年生甘遂中大戟二烯醇含量最高，4年生甘遂中大戟二烯醇含量最低。

表3 不同生長(zhǎng)年限春季采收期京大戟和甘遂中大戟二烯醇含量比較Table 3 Comparison of euphol from E .pekinensis and E kansuiin spring harvesting periods with different growing years

2.6 不同采收期京大戟和甘遂中大戟二烯醇含量比較

取不同采收期的京大戟和甘遂供試樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算大戟二烯醇含量。從表4 可以看出，京大戟在秋季采收時(shí)的大戟二烯醇含量比春季采收時(shí)高，甘遂在春季采收時(shí)的大戟二烯醇含量比秋季采收時(shí)高。

表4 不同采收期京大戟和甘遂中大戟二烯醇含量比較Table 4 Comparison of euphol from E .pekinensis and E kansuiin different harvest periods

3 討論與結(jié)論

3.1 提取溶劑選擇

2015年版《中國(guó)藥典》中，甘遂藥材含量測(cè)定的供試品處理方法中的提取溶劑為乙酸乙酯，京大戟藥材含量測(cè)定的供試品處理方法中的提取溶劑為甲醇。試驗(yàn)中2 種藥材分別用2 種溶劑提取后比較發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯對(duì)2 種藥材中大戟二烯醇有更高的提取效率，故選定乙酸乙酯作為提取溶劑。

3.2 不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量存在一定差異

不同產(chǎn)地的藥材中大戟二烯醇含量存在較大差異。以江蘇產(chǎn)的京大戟中大戟二烯醇含量最高，廣西產(chǎn)的大戟二烯醇含量最低且未達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)；以山西產(chǎn)的甘遂中大戟二烯醇含量最高，以陜西產(chǎn)的大戟二烯醇含量最低。

在藥材市場(chǎng)搜集京大戟藥材過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)多數(shù)商家以紅大戟代替京大戟出售，或者將紅大戟和京大戟統(tǒng)稱為大戟出售。分析原因可能京大戟多為野生、產(chǎn)量少，紅大戟多為種植、產(chǎn)量大，并且二者均有泄水逐飲之功效。大戟二烯醇是京大戟和甘遂的有效成分之一，保證大戟二烯醇的含量才能基本保證藥效。然而參閱文獻(xiàn)，并無(wú)紅大戟中發(fā)現(xiàn)有大戟二烯醇成分的報(bào)道，所以以紅大戟替代京大戟用藥是極不合理的。購(gòu)買時(shí)需加以區(qū)分，謹(jǐn)慎購(gòu)買[10]。

3.3 最佳采收時(shí)間

不同生長(zhǎng)年限的藥材中大戟二烯醇含量存在差異。比較2、3、4年生的藥材中大戟二烯醇含量發(fā)現(xiàn)，3年生京大戟中大戟二烯醇含量最高，4年生京大戟中大戟二烯醇含量最低；2年生甘遂中大戟二烯醇含量最高，4年生甘遂中大戟二烯醇含量最低。京大戟在秋季采收時(shí)的大戟二烯醇含量比春季采收時(shí)高，甘遂在春季采收時(shí)的大戟二烯醇含量比秋季采收時(shí)高。該研究結(jié)果可為藥農(nóng)確定京大戟和甘遂最佳生長(zhǎng)年限及采收期提供科學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步擴(kuò)大開(kāi)發(fā)和利用京大戟和甘遂資源提供科學(xué)依據(jù)。