鐵皮石斛組織培養工廠化育苗及原生態栽培技術研究

謝騰飛，張華通，何旭君，賴增哲，李慧釵，趙靜

（廣東生態工程職業學院，廣東 廣州 510520）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是蘭科石斛屬類植物，種類繁多，廣泛分布在亞洲、歐洲、澳洲等地區[1]，在我國主要分布于廣西、廣東、福建、四川、浙江、云南和貴州等西南和華南地區。野生鐵皮石斛為附生性多年生蘭科植物，主要生長在溫度濕潤、半陰濕的巖石上或者疏林中的樹干上，對生態環境要求苛刻，生長溫度為20～26℃，空氣濕度要求需要達到70%～85%。據《中國藥典》版記載，鐵皮石斛歸胃、腎經；益胃生津，滋陰清熱。鐵皮石斛用于治療不明發熱、口干舌燥、目暗不明、陰虛火旺、陰傷津虧、胃陰不足、食少干嘔、病后虛熱不退、筋骨無力等病癥，是傳統的保健中藥材之一[2-3]。

由于野生鐵皮石斛資源較為稀缺，加上人們對野生資源的過度采挖，從而導致有些品種已瀕臨滅絕。[4-6]目前，鐵皮石斛產業都注重于種植技術的研發和規模的擴大，而組織培養工廠化育苗是一種人工栽培非常重要的育苗方式[7]。研究結果表明，種齡、滅菌方式、外植體選擇、接種密度、繼代周期、培養基配方、移苗方式等諸多關鍵技術對鐵皮石斛組織培養快繁效果影響很大[8-9]。據宋爽等[10]報道，不同的栽培技術對鐵皮石斛的質量具有明顯的影響，其中以野生資源的鐵皮石斛質量最佳。因此，大力開展原生態栽培技術研究與推廣是提高鐵皮石斛質量的一種有效途徑。

本研究基于鐵皮石斛的組織培養工廠化育苗關鍵技術研究，對工廠化生產育苗工藝流程進行優化，探索試管苗移植栽培管理技術，以求建立適用于生產的優質鐵皮石斛種苗快速繁育體系，并通過原生態栽培種植，探索仿野生鐵皮石斛適宜生長條件，為提高鐵皮石斛仿野生種植效益提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用鐵皮石斛由廣東生態工程職業學院生物技術綜合實訓基地提供的組織培養苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 鐵皮石斛無菌播種工廠化生產育苗簡易工藝流程 外植體主要采用優質種果，無菌條件下取種子進行培養；采用MS 培養基，附加細胞生長素NAA0.1～0.6mg/L 和馬鈴薯 20～50g/L 及蘋果泥 20～50g/L。并在無菌條件下，進行鐵皮石斛的無菌播種及組織培養繼代增殖。無菌播種發芽培養及初代培養其培養溫度為25±2℃，光照時間為10～12h，強度控制在2000～3 000lx。經90 d 左右培養即可萌發出大量的小苗。以后均采用同一培養基，每90 d 轉接1 次，連續轉接2 次，小苗嫩莖長到3 cm 左右，根系完整即可進行煉苗移栽。

1.2.2 試管生根苗處理 經培養室壯苗生根培養約30 d 的小苗置于塑料大棚進行煉苗，經生根煉苗60 d 后，選擇苗高3～5cm、生長正常、長勢較好的試管生根苗。用鑷子輕輕地夾出煉好的試管生根苗，置于裝有干凈自來水的塑料盆里，清洗2 遍，以洗凈培養基。并用0.01%的高錳酸鉀溶液浸泡5min，自來水清洗，甲基托布津水溶液浸泡2 min。

1.2.3 試管生根苗種植及栽培管理 試管生根苗在清洗消毒后，栽植于遮陽網墊底，長 寬 高為50 40 7cm，排水良好的塑料篩中。種植時，用手輕捏，使試管生根苗的根部與基質充分接觸。種植后，放在有遮陰的標準塑料大棚進行栽培管理。最初2 d 內不用澆水，第3 天開始淋第1 次促根殺菌營養液（翠筠B1 營養劑+多菌靈+磷酸二氫鉀溶液），以后每10 d噴施該溶液1 次并保持種植基質經常處于濕潤狀態。與此同時，需要防治病蟲害。

1.2.4 不同方法處理鐵皮石斛試管苗移植對比試驗本試驗對試管苗消毒后進行2 個對比處理，分別為消毒后晾苗2 d 后種植（水珠干透、根系變白）和洗苗消毒后直接種植，并記錄移植60 d 后的生長情況。

1.2.5 移栽培養基質篩選試驗 單一移栽基質篩選：本試驗采用松樹皮、木屑、苔蘚、泥炭土、紅火山巖等5個處理，對移植60 d 后試管生根苗的生長情況進行觀察分析。

混合移栽基質篩選：本試驗移栽基質設計為J1（木屑∶松樹皮=3∶2）、J2（木屑∶陶粒=3∶2)、J3（苔蘚∶小石粒=3∶2）、J4（泥炭土∶陶粒 3∶2）、J5（紅火山巖∶小石粒3∶2）、J6（松樹皮∶紅火山巖3∶2）6 個處理，記錄移植60 d 后的生長情況。

1.2.6 不同季節栽培對比試驗 本試驗設計為春（3～5月）、夏（6～8 月）、秋（9～11 月）、冬（12～2 月）4 個季節對馴化苗移栽成活及生長情況的影響。栽培基質為J6（松樹皮∶紅火山巖3∶2），采用3 寸盆種植。移栽后，記錄栽培苗的生長情況。

1.2.7 鐵皮石斛的原生態栽培方式對比試驗 本試驗采用枯立木附生種植、吊籃種植和活樹體附生種植3個對比處理。枯立木附生種植選擇直徑為15 cm 左右的原木，置于光線充足、遮陰樹下光照通透的位置，在原木皮層按株距20 cm 的密度種植，用少量苔蘚包裹后貼于樹皮上，再用麻繩綁緊固定，根系要求自然伸展；吊籃掛在樹枝上，保持吊籃處透光較足，且避免強光直接照射；活樹體附生種植選擇附生樹中光線充足、通透的枝干部位，按株距20 cm的密度種植，用少量苔蘚包裹后貼于樹皮上，再用麻繩綁緊固定，根系要求自然伸展；種苗規格為鐵皮石斛組織培養馴化苗達到主莖長6 cm 以上，輔莖長4 cm 以上；主莖粗0.4 cm 以上，輔莖粗0.1 cm以上。記錄附生及種植后的生長情況。

2 結果與分析

2.1 工廠化生產育苗簡易工藝流程獲得鐵皮石斛組培苗

本實驗室通過對種子消毒，嚴謹的無菌操作及良好的誘導、壯苗培養基等技術的研究，探索出了鐵皮石斛無菌播種工廠化生產育苗簡易工藝流程：鐵皮石斛莢果外植體消毒→種子無菌發芽培養→無菌小苗轉接增殖培養→塑料大棚生根煉苗→試管生根苗種植。整個過程只采用一種培養基為MS+NAA（0.1～0.6 mg/L）+馬鈴薯泥（20～50g/L）+蘋果泥（20～50g/L）+蔗糖（30g/L）。利用這一技術培育出大量的鐵皮石斛優質種苗，以滿足后續試驗及生產的需求（圖1）。

圖1 鐵皮石斛工廠化組培苗Fig.1 Tissue culture seedlings of D.otticinale

2.2 不同方法處理鐵皮石斛試管苗移植結果

對比試管苗消毒后晾苗2 d 后種植（使附苗上無水珠、根系變白）和洗苗消毒后直接種植〔移栽基質均采用J1（木屑∶松樹皮=3∶2）〕，移植于標準塑料大棚進行栽培管理，期間對移植后試管苗根、苗的生長狀況及移植成活率進行觀察記錄，并在60 d 后統計其移栽成活率。從表1 中可得出，鐵皮石斛試管苗經晾苗處理后，平均移栽成活率達到95.0%，明顯優于試管苗直接種植的72%成活率；根和苗生長比較結果，試管苗經晾苗處理后8 d 左右可以長出新根，而直接種植的試管苗要在14 d 后才能長新根，新根長度較短，較為嚴重的是，有些根出現腐爛情況；經晾苗處理后的試管苗在大概10 d能長出新葉，而直接種植的試管苗長勢較差，并部分苗出現腐爛。因此，可以得出晾苗處理有利于鐵皮石斛試管苗移植生長。

2.3 移栽培養基質篩選試驗結果

為了解單一移栽基質在鐵皮石斛試管苗移植培養中的效果，通過采用松樹皮、木屑、苔蘚、泥炭土、紅火山巖等5 種基質進行栽培，期間對移栽后試管苗的生長狀況及移植成活率進行觀察記錄，并統計其移栽成活率，結果（見表2）顯示，單一基質的培養中，松樹皮基質培養的效果最好，成活率達到89.5%，而在泥炭土中，培養成活率只有32.1%；試管苗在松樹皮、木屑中生根較為理想，在苔蘚、泥炭土及紅火山巖基質中，根長勢很差，根細且短，還出現部分腐爛現象。

表1 鐵皮石斛試管苗移植中不同處理方法的對比試驗Table 1 Different treatment methods in D.otticinaletube seedling transplantation

在采用不同混合基質培養鐵皮石斛試管苗移栽的結果顯示，在J1、J2 和J6 這三種混合基質中，成活率達到90%以上，在J4 和J5 中的成活率較低，分別為68.0%、76.0%。在成活率較高的三種混合基質中，我們也發現在一個星期內可以長出新根，根系發達，根長且較粗壯。而J4 和J5 基質根長勢差，很細弱。苗的新芽萌發及葉片增加的速度在J1、J2 和J6 混合基質中明顯優于成活率較低的混合基質。本試驗結果表明，以J6 為基質栽培效果最好，而且也符合經濟原則（見表3）。

表2 鐵皮石斛試管苗移植中不同單一移栽基質中的種植對比試驗Table 2 Different single transplanting substrates in D .otticinaletube seedling transplantation

表3 鐵皮石斛試管苗移植中不同混合移栽基質中的種植對比試驗Table 3 Different mixed transplanting substrates in D .otticinaletube seedling transplantation

2.4 鐵皮石斛不同季節栽培對比試驗結果

為了解鐵皮石斛試管苗在不同季節移植栽培的效果，我們進行了春夏秋冬的移植對比，結果（見表4）顯示，春季和秋季的栽培效果最好，成活率高達92.0%和96.0%，而夏季和冬季栽培效果不理想。雖然秋季成活率較高，但試驗發現，其根系發育速度明顯落后于春季（長根時間分別為20 d 和58 d）。在冬季，鐵皮石斛移栽成活率僅為26.5%，未見新根有明顯變化。苗的生長情況也存在相同趨勢，春天移栽的試管苗生長快。其次為秋季、夏季。而冬季苗未見長高，只是莖稍有長粗。試驗結果表明春季是鐵皮石斛栽培種植的最佳選擇，秋冬季時生長緩慢，尤其是冬季，不適宜栽培種植鐵皮石斛。

2.5 鐵皮石斛的原生態栽培方式對比試驗結果

由于鐵皮石斛主要在野外附生性生長，為保證鐵皮石斛的價值，需要采用原生態的栽培方式（圖2）。本試驗中，我們采用了枯立木附生種植、吊籃種植和活樹體附生種植這三種原生態的栽培方式。結果顯示吊籃種植的成活率最高，高達95.0%，其次為活樹體附生種植（89.5%），枯立木附生種植（85.5%）。而且吊籃種植的根系生長也是最快的，但活樹體附生種植的根系最為發達，可以和活體樹皮相互緊密纏繞。苗的生長速度差別不大。本試驗表明，在原生態栽培過程中，吊籃種植的生長情況最好，但也發現活樹體附生種植鐵皮石斛的效果也不錯（表5）。

圖2 鐵皮石斛的原生態栽培Fig.2 Ecological cultivation of D.otticinale

3 討論與結論

鐵皮石斛為多年生附生蘭的草本植物，在野外狀態下，鐵皮石斛種子繁殖力低，在發芽率、萌發、生長，及開花的鐵皮石斛結實率也很低[11]，這些原因導致其有性生殖的自然繁殖率低。而需求量的快速增加，加急了鐵皮石斛的稀缺。因此，隨著組織培養技術的發展，利用組織培養的種苗，并采用人工大規模種植的鐵皮石斛是市場上產品的主要來源[12]。本實訓中心主要以組織培養技術研究為主，培養了菊花、金叉石斛和迷迭香等多種經濟植物[13-14]，有一套非常完善的組織培養及工廠化育苗的技術。通過不斷摸索，已經建立了一套成熟的鐵皮石斛組培方法，并能進行工廠化生產育苗，該技術成活率高、可產出高質量苗。在此期間，我們發現試管生根苗移栽過程處理是鐵皮石斛組培成功運用于生產的重要步驟，因此對此進行了詳細的研究。與此同時，本研究還嘗試了不同的原生態種植方法，以求獲得高質量的鐵皮石斛鮮條，滿足市場需求。

獲得能夠移栽到田間的鐵皮石斛苗是繁育技術的核心問題，因此需要保證移栽的成活率。楊大贊報道認為在試管苗清洗時，根莖都很脆弱，易受到真菌感染，最好進行根系的脫水處理[15]。本試驗結果證明了這個觀點，通過比較晾苗2 d后種植和直接種植處理，晾苗后成活率明顯較高；根的生長良好，苗長葉及發育也快，而直接種植的試管苗的根會出現腐爛現象，這應該是跟真菌感染有關，而芽的長勢也比較差。本研究表明采用洗苗消毒后晾苗2 d的處理方法，有助于鐵皮石斛試管苗的移植生長。

培養基質對植物的影響是顯而易見的，在選擇植物培養基質時，需要結合實際生長情況，從而保證成活率和生長態勢。一般認為，不同種類的微生物會附生在野生的鐵皮石斛根系中，從而分解土壤中的有機物。因此，人工基質很難達到自然的效果。因此，會選擇碎石子、泥炭土、火山巖和木屑等作為培養基質。有研究報道木屑、泥炭土的保水能力較好質，椰子絲、松樹皮可以增加基質的透氣性，不同基質的混合使用不僅可以滿足基質保水需求，還可以改善基質的透氣[16]。本試驗顯示單一基質最高的成活率僅為 89.5%（松樹皮），大部分單一基質中的成活率都較低。松樹皮+紅火山巖（3∶2）為混合基質栽培時，成活率最高，根的長勢也是最好。在單一基質如泥炭土、紅火山巖中，鐵皮石斛根系還發生了部分腐爛現象。由此，本研究得出的試管生根苗最佳移栽基質為木屑+松樹皮，既有較好的保水能力，還能透氣。

由于光照、溫度和水分對鐵皮石斛的生長有重要作用[17-18]，因此，不同栽植季節對鐵皮石斛生長的影響也是顯而易見的。通過對福建地區鐵皮石斛種植的季節影響進行探索，結果顯示，鐵皮石斛在春、秋、夏季其單叢鮮重、萌芽數生長有極顯著差異，以春季栽植為優，秋季則次之，秋季栽植則應做好抗寒防凍工作[19]。在廣東，我們也發現了相同的趨勢。在夏季，可能由于溫度太高，鐵皮石斛的成活率和長勢都不好。而冬季是鐵皮石斛營養積累的時期，加之溫度過低，其栽培成活率非常低。本研究得出春季是鐵皮石斛栽培種植的最佳季節。

環境因子會使植物表型及生理生態特性產生不同的變化[20]。鐵皮石斛的組培苗、大棚栽培植株及野生植株營養成分比較發現，野生栽培鐵皮石斛的多糖含量高于人工栽培的鐵皮石斛，還有人工栽培鐵皮石斛所含微量元素低于野生栽培[21]。而且，采用樹皮等仿生基質有助于提高鐵皮石斛的蛋白質和多糖等營養物質的積累。因此，原生態種植是鐵皮石斛栽培的重要方式。目前報道的原生態種植主要采用活樹體附生種植。崔之益等[22]分別采用降香黃檀、馬占相思、龍眼、楊桃等進行鐵皮石斛附生種植，結果顯示，其生長的莖粗細、長短及生物產量與其植株高度呈顯著性相關。枯立木附生種植和吊籃種植的研究較少，主要適用于樹木不多的林地種植。本研究發現吊籃種植中鐵皮石斛的成活率及根苗長勢最好，這可能與而其遠離地面種植，生長空間大，光環境和通風環境均優于其它原生態栽培方式，能有效促進鐵皮石斛生長。本試驗結果說明，除活樹體附生種植外，吊籃種植也是一種比較好的種植栽培模式選擇。枯立木附生種植雖比活立木種植、吊籃種植表現稍差，但采用活立木種植和吊籃種植結合進行，可以充分利用空間，大大提高了單位面積鐵皮石斛的鮮條產量。

試管苗的移栽是鐵皮石斛組織培養工廠化育苗中的一個關鍵環節。由于試管苗始終處于一個相對穩定的無菌環境下，對外界自然環境的適應性其是否移植成功決定影響試管苗移栽成敗因素包括馴化苗的選擇、栽培基質的選擇和溫度濕度光照等。本研究以組培生根的鐵皮石斛試管苗為材料，通過試驗，證明了鐵皮石斛試管苗移植過程中，通過晾曬2 d 處理有助于提高移植是成活率；最優的基質為松樹皮+紅火山巖（3∶2）混合，是生產容易推廣的材料，具有潛在的經濟效益。栽培試驗結果顯示，種植栽培的季節應當以春季為優，氣溫適宜，空氣濕度大。秋季應做好抗寒防凍工作。夏季和冬季由于氣候，不利于鐵皮石斛生長。原生態栽培對比證明吊籃種植是除活樹體附生種植外的理想方式。這為尋找鐵皮石斛組培工廠化育苗尋找更為高效的移栽方法，及大面積推廣原生態鐵皮石斛栽培提供技術參考。