CPV-2c型犬細小病毒分離及其VP2序列分析

施鵬飛，程悅寧，馮二凱，羅國良，王振軍，易立

（中國農業科學院特產研究所，吉林 長春 130112）

犬細小病毒病（Canine parvovirus disease）是由犬細小病毒（Canine parvovirus，CPV）感染所引起的一種急性、高度接觸性傳染病，以出血性腸炎或非化膿性心肌炎為主要特征，主要感染幼犬消化道[1]。美國科學家Eugstet等1977年首次通過電鏡在患病犬腹瀉物中發現CPV 顆粒[2]。我國于1982年由軍事醫學科學院軍事獸醫研究所首次分離出CPV。目前，CPV 在我國東北、華北、華中等地區廣泛流行[3-4]。CPV 基因組全長約5 300 bp，其中包含2 個開放閱讀框，分別編碼結構蛋白（VP1 和 VP2）和非結構蛋白（NS1 和 NS2），其中衣殼蛋白VP2 主要影響CPV 的抗原性和宿主范圍[5]。根據 CPV 中 VP2 基因出現的氨基酸替換，分為CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c，New CPV-2a、New CPV-2b等基因型。目前，CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c，New CPV-2a、New CPV-2b 等新基因型已經取代了CPV-2，在世界范圍內廣泛傳播[6-8]。2014年，我國分離和鑒定出CPV-2c 病毒，同時發現該病毒已經發生新的突變，證實了CPV 在我國繼續發展[9]。本研究從疑似CPV 感染的犬糞便病料中分離出了CPV，并且對其VP2 序列進行基因推導氨基酸分析，然后進行進化樹分析，旨在豐富新型CPV-2c 變異體的遺傳數據，為后續流行病學研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 毒株及細胞株

F81 細胞、犬細小病毒陽性毒株、CPV鑒定引物均保存于中國農業科學院特產研究所特種動物病原與免疫實驗室。

1.2 主要試劑與儀器

1.3 病料來源及處理

糞便樣品采集于武漢寵物醫院的患病犬只，主要臨床癥狀為腹瀉、精神抑郁等。取采集的糞便樣品0.6 g置于1.5 mL EP管中，用PBS按1∶8 的比例進行稀釋混勻，于4 ℃下12 000 r/min 離心3 min；取上清液經0.22m濾膜過濾，將處理后的上清液樣本置于 80 ℃下保存備用。最后取出部分病料溶解液，使用犬瘟熱、犬細小、犬冠狀病毒試紙條進行鑒定。

1.4 病毒分離

1.5 VP2全基因擴增及序列分析

根據NCBI 網站上已發表的CPV-2 株（GenBank登錄號為M38245）基因序列，設計擴增VP2 基因全長的引物，引物序列 VP2-F 為 5'-ATGAGTGATGGAGCAGTTC-3',VP2-R 引物序列為 5'-AATATAATTTTCTAGGTGCTAG-3'，預期擴增片段大小為1 750 bp。PCR 條件為 95 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 10 min，共 30 個循環。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，條帶大小正確后，膠回收連接pMD-18T 載體，轉化DH5感受態大腸桿菌，挑取陽性菌落提取質粒，并送交吉林省庫美生物科技有限公司測序，查找GenBank上已發表的國內外不同基因型的CPV毒株VP2 基因序列，使用MEGA 7.0 軟件進行基因序列及氨基酸序列同源性分析，并繪制進化樹。使用DNAMAN 軟件對序列數據進行轉換、分析和比較。進化樹的繪制使用MEGA 7.0 軟件，系統種系發生樹的構建基于Neighbor-joining 程序，驗證采用Bootstrap=500 trails。本研究選取18 株犬細小病毒參考毒株進行了分析。

2 結果與分析

2.1 病毒分離

經試紙條鑒定可知，犬細小病毒試紙條檢測結果為陽性，犬瘟熱和犬冠狀病毒試紙條檢測結果皆為陰性。2c-I 樣品接種單層培養的F81 細胞，并觀察細胞病變。從圖1 可以看出，2c-I 樣品接毒后48～72 h 細胞出現拉網、脫落典型的細胞病變，少部分細胞死亡聚集在一起。對照組細胞正常；接毒組細胞連續盲傳3代，觀察到比較穩定的細胞病變現象，證明成功分離到1 株病毒，暫命名為 2c-I。

圖1 接毒后細胞病變Fig.1 Cytopathic effect after intoxication

2.2 VP2基因擴增結果

用VP2 全基因引物對CPV分離株2c-I的VP2 基因進行PCR 擴增，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，在1 750 bp左右出現目的條帶，與預期結果相符(圖2)。將 PCR 產物回收并克隆到 pMD18-T 載體（TaKaRa 公司）上，具體步驟均參照試劑盒說明書操作。連接成功后，DH5感受態細胞轉化，挑取單克隆菌落至試管中培養，經菌液PCR 鑒定陽性的，再提取質粒進行測序。

2.3 測序結果分析

將此次分離的1 株犬細小病毒和來自 GenBank數據庫中具有地域代表性的10 株 CPV 毒株 VP2 基因所推導的氨基酸序列，采用Clustal W方法進行相互比對，結果見表1。由表1 可知，本研究中的2c-I 株犬細小病毒流行株屬于CPV-2c亞型（Glu426），2c-I毒株序列呈現獨特的變異：Phe267 至Tyr267 出現變異。VP2 測序結果已經上傳至 NCBI 網站，登錄號為MN686018。

圖2 CPV 分離株VP2 基因擴增結果Fig.2 The amplification result of VP2 gene from CPV isolated strain

表1 CPV VP2 基因推導氨基酸分析Table 1 The deduced amino acid analysis of VP2 gene of CPV

2.4 系統進化樹分析

利用MEGA7.0 軟件，對2c-I 株犬細小病毒以及GenBank 數據庫中6 株國內和15 株國外細小病毒參考毒株的VP2 蛋白氨基酸序列建立了系統進化樹（圖3）。從圖3 可以看出，CPV分離株2c-I與國內的LZ-2、HRB-A6、SH1516 等同屬于CPV-2c 亞型。本研究建立的進化樹在選取CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c在內的多株細小病毒的基礎上，重點選取6 株國內2016—2018年分離的CPV-2c 亞型毒株，并重點分析了CPV-2c 亞型在國內的遺傳變異情況。從拓撲分類上，CPV 分離株2c-I 與所選的6 株國內毒株同源性都很接近，但又不在同一分支上，結合其267 位氨基酸突變為酪氨酸（Tyr）情況來看，則暗示著在未來我國境內可能出現新的CPV-2c 亞型變異，需要重點監測。本研究中的CPV分離株2c-I 與2016年四川分離株CPV-2c 非常接近，同源率為99.8%。根據進化樹分析可知，目前我國流行的犬細小毒株有 New CPV-2a、New CPV-2b、CPV-2c，其中CPV-2b 和CPV-2c 主要在南方流行，而北方地區則較少。

圖3 CPV VP2 核苷酸序列遺傳進化樹Fig.3 The nucleotide sequence genetic tree analysis of VP2 gene of CPV

3 討論

犬細小病毒的主要宿主是幼犬，幼犬感染CPV后發病率高達90%，致死率為35%左右。不同生長期的幼犬感染犬細小病毒后出現不同的臨床癥狀，子宮內胎兒或8 周齡以下幼犬感染多表現為心肌炎型，2～6 月齡幼犬感染多表現為腸炎型[10]。目前，世界范圍內主要流行的毒株為CPV-2a 與CPV-2b 亞型，但在阿根廷等國家流行毒株則以CPV-2c 亞型為主[11]。據報道，我國目前流行的毒株主要為 CPV-2a 亞型，其次是CPV-2b亞型，2010年報道我國有CPV-2c亞型的發生，但未形成大規模流行[12]。本研究中的犬細小病毒為細小病毒 Type2c 亞型。從分離株（MN686018）VP2 基因推導的氨基酸序列顯示，與我國境內流行的CPV-2c型相比，此次分離的細小病毒分離株雖然在分型的關鍵位點第426 位沒有突變，但在第267 位點出現變異，推測其原因是由于265～267 位點并沒有展示在細小病毒衣殼表面；同時，此次分離的細小病毒分離株與經典的CPV-2c型的VP2 氨基酸序列對比發現，2c-I的324位點突變為異亮氨酸（Ile）成為2C亞型中的新突變位點，這將對今后新亞型的出現產生一定的影響。值得注意的是，VP2 蛋白的324 位點氨基酸在蛋白和犬的轉鐵蛋白（Trf）結合中起重要作用，所以2c-I 毒株中VP2 蛋白的Trf結合能力是否隨突變而改變需要進一步研究驗證。324 位點的突變（Tyr→Ile）于 2004年在我國首次被發現，并在日本、韓國等亞洲地區都檢測到該位點的突變[13]。以上2 個非關鍵位點的氨基酸變異對病毒的毒力、蛋白的表達以及宿主范圍是否有直接的影響則有待進一步研究。依據本研究對犬細小病毒VP2 核苷酸序列進化樹分析結果，此次分離的2c-I細小病毒野毒序列屬于CPV-2c 亞型，與南美洲國家、意大利、美國的2c 亞型是有區別的，但與四川CPV08比較接近，據此推測，犬細小病毒的流行具有一定的地域性。由于新的突變位點的發現，所以應該加強對我國CPV-2c 亞型的監測，同時也要對可能出現的抗原表位改變和宿主范圍擴增做出相應的預測。

本研究成功分離并鑒定出1 株CPV-2c，并進行了犬細小病毒2c型的分子流行病學調查，這不僅可為寵物疾病的防控提供有力依據，而且可以為特種經濟動物養殖行業和野生動物保護奠定理論基礎。