人工RNA結合骨架的可溶性表達及其與寡核苷酸鏈的相互作用分析

徐如飛，徐奕倩，陳倩倩，蔣培蓉，陳美雯，蒲首丞，孫梅好

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華321004）

PUF結合因子（Pumilio/fem-3 binding factor）是一種存在于真核細胞、結合單鏈RNA分子的RNA結合蛋白，具有轉錄后調控蛋白質表達的重要功能。PUF由RNA結合骨架（RNA-binding scaffold，RBS）和輔助結構域構成，其RNA結合骨架大部分含有由α-螺旋構成的8個RNA結合域（RNA binding domain，RBD），天然PUF堿基特異性的解析為人工設計特異性結合任意8個核苷酸RNA分子的RBS（engineered RBS，ERBS）奠定了基礎[5]。

PUF蛋白家族是RBP中的一個大家族，存在于所有真核生物中，其基因的拷貝數在不同物種中差異很大。PUF蛋白主要通過特異性結合目標mRNA的順式作用因子，影響mRNA的穩定性、定位和翻譯過程，參與胚胎形成、細胞發育和分化等過程，實現基因的轉錄后調控[6-8]。

據報道，在原核細胞中，PUF蛋白結合于靶基因的RBS和起始密碼子之間，調控翻譯；在真核細胞中，PUF蛋白結合于靶mRNA的5′非翻譯區，顯著抑制了靶基因的表達[9]。調控機制可能是由于PUF蛋白結合RNA之后，與其他的蛋白相互作用，進而抑制翻譯或引起mRNA降解[10]。

利用Escherichia coli等原核表達體系表達重組蛋白，由于表達水平高及二硫鍵發生錯配，導致80%會以不溶性的包涵體形式存在[11-12]，在分離純化蛋白之前，需要經過變性和復性，變性的蛋白質因為構象被破壞，不具備生物學活性。因此，需要通過復性使蛋白質恢復其天然構象狀態，具有正確的生物學功能。變性和復性的過程比較復雜，而且難度大，因此，可溶性表達重組蛋白具有很重要的生物學意義[13-14]。

據報道，提高重組蛋白的可溶性表達可以采用以下幾種方式：第一，選擇合適的宿主，BL21（DE3）是通常選擇的宿主細胞[15]；第二，構建蛋白，比如將目的蛋白與一些可溶性蛋白表達，可以提高目的蛋白的溶解性，但是分離純化之后需要切除輔助蛋白[16-19]；第三，降低培養溫度，大腸桿菌的最適生長溫度為37℃左右，因此，37℃誘導蛋白很容易導致不溶性的包涵體形成，研究顯示，低溫誘導更有利于正確蛋白的折疊，導致其可溶性增加[20-24]；第四，改善誘導條件，在菌體生長的對數生長期誘導，更有利于可溶性蛋白的形成，降低誘導劑的使用量有利于蛋白的緩慢表達，從而更有利于可溶性蛋白的形成[25]。

本研究利用ERBS蛋白可以結合單鏈RNA的特點，設計5'-FAM標記寡核苷酸，通過檢測5′-FAM標記寡核苷酸熒光強度的變化來分析ERBS蛋白與寡核苷酸的相互作用。

1 材料和方法

1.1 材料

Escherichia coliDH5α、BL21（DE3）、Rosetta（DE3）感受態細胞、pET-24a-CYFP載體均由浙江師范大學化學與生命科學學院細胞實驗室保存；含ERBS基因的載體pUC57-ERBS、寡核苷酸鏈由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；限制性核酸內切酶Not I、Sal I、PCR相關試劑、T4 DNA Ligase等購自寶生工程（大連）有限公司；IPTG、氨芐青霉素、卡納霉素、酵母提取物、胰蛋白胨均購自Oxoid LTD公司（Hampshire，England）；DTT、溶菌酶、Pepstatin A購自Amresco公司；PMSF為BBI產品；Ni-NTA His-Bind SuperflowResin購自Novagen公司；超濾管購自Millipore公司。其他常規生化試劑均購自國內公司，為分析純。

1.2 構建載體所需引物

根據已知的基因序列，用Primer premier 6.0設計引物，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，所用引物如表1所示。通過引物ERBS-F與ERBS-R進行PCR擴增，得到含有Not I、Sal I酶切位點的ERBS，從而將其構建到pET-24a-CYFP載體中。

3.1.2 清創 采用自溶性清創法進行清創［6-7］。嚴格執行無菌技術，以0.9%氯化鈉棉球徹底清洗傷口，將壞死組織及膿性分泌物清除干凈。水凝膠均勻涂抹于壞死區，無粘性泡沫敷料保濕覆蓋，低敏寬膠帶封貼［8］。第2天就診時發現滲液中等量，黑色壞死組織變軟并且部分脫落，按照保守性銳器清創指南使用無菌剪刀，用血管鉗分離和提起壞死組織并剪除［5］。

表1 構建載體所用引物

1.3 合成寡核苷酸鏈

設計ERBS特異性識別并結合的寡核苷酸，5′加FAM熒光基團（表2）。

表2 合成的寡核苷酸鏈

1.4 方法

1.4.1 pET-24a-ERBS表達載體的構建設計可以結合5′-ACAGCGGC-3′的ERBS基因序列，合成于pUC57-SmalI；以pUC57-ERBS為模板，利用引物ERBS-F和ERBS-R擴增之后，其PCR純化產物與pET-24a-CYFP質粒通過雙酶切（Not I、Sal I）及割膠回收后，二者的割膠回收產物經16℃連接過夜，將連接產物轉化至DH5α，酶切驗證正確之后轉化BL21（DE3），獲得pET-24a-ERBS表達菌株。

1.4.2 BL21（DE3）中ERBS蛋白的表達挑取pET-24a-ERBS表達菌株單菌落至含4 mL LB培養基（含Kana抗性）的試管中，37℃220 r/min搖床振蕩培養過夜。將試管菌液轉移至500 mL LB培養基中擴大培養，培養至OD600為0.4～0.6時，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，16℃誘導過夜后，離心收集菌體，使用磷酸鈉溶液（pH＝8.0），加入pepstatinA、PMSF、溶菌酶，4℃裂解1 h，超聲波破碎后離心，分離上清及沉淀，將樣品處理后進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.4.3 Rosetta（DE3）中ERBS蛋白的表達提取pET-24a-ERBS（BL21）質粒，轉化Rosetta（DE3）。挑取單菌落至含4 mL LB培養基（含Kana抗性）的試管中，37℃220 r/min搖床振蕩培養過夜。將試管菌液轉移至500 mL LB培養基中擴大培養，培養至OD600為0.4～0.6時，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，16℃誘導過夜后，離心收集菌體，使用磷酸鈉溶液（pH＝8.0），加入pepstatinA、PMSF、溶菌酶，4℃裂解1 h，超聲波破碎后離心，分離上清及沉淀，將樣品處理后進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

將破碎上清通過鎳柱純化，采用0、5、50、100 mmol/L咪唑梯度洗脫目的蛋白，蛋白電泳顯示，100 mmol/L咪唑可以將目的蛋白完全洗脫下來，將100 mmol/L咪唑洗脫溶液進行透析獲得的蛋白樣品，利用3 ku超濾管低速離心濃縮蛋白。蛋白濃度根據Bradford法[20]測定。

1.4.4 光譜分析利用安捷倫Cary 4000紫外-可見-近紅外分光光度計的Kinetic程序，在激發波長為494 nm、發射波長為521 nm的條件下，測定不同濃度的ERBS蛋白與5′-FAM標記寡核苷酸相互作用的吸光值，計算解離常數。

2 結果與分析

2.1 ERBS的基因序列（5'-3'）及其對應的氨基酸序列

以人的PUM1的RBD（G828-Y1168，PDB：1M8Y）為骨架，根據已經解析的RBD對應RNA的4種堿基的識別密碼，設計ERBS的氨基酸序列，送至生物工程公司優化、合成大腸桿菌表達ERBS蛋白所需的核苷酸序列（圖1），黃色區域為ERBS的8個RNA結合結構域，3′-5′依次結合RNA堿 基ACAGCGGC。

2.2 ERBS片段的獲得

ERBS片段使用ERBS-F、ERBS-R引物通過PCR擴增得到，其擴增結果如圖2所示，產物長度為1 000 bp左右，符合預期。割膠回收后酶切（Not I＋Sal I），然后連接到pET-24a-CEYFP載體上，通過菌液PCR篩選出陽性克隆，構建重組質粒載體pET-24a-CEYFP-ERBS。

2.3 蛋白純化結果

2.3.1 BL21（DE3）中ERBS蛋白的表達結果為了分析ERBS與其對應核苷酸的特異性互作，將ERBS通過BL21（DE3）表達菌株進行表達，并收集其破碎上清與沉淀進行SDS-PAGE電泳，結果顯示（圖3），蛋白誘導成功但大多數蛋白都形成了包涵體存在于沉淀中，包涵體的純化需要經過復雜的變性復性過程，給后續的試驗造成了很大的麻煩。

2.3.2 Rosetta（DE3）中ERBS蛋白的表達結果為了獲得可溶性的ERBS，提取pET-24a-ERBS（BL21）質粒，轉化Rosetta（DE3）進行表達純化，SDS-PAGE電泳結果顯示（圖4），蛋白誘導成功，且為可溶性蛋白，并且通過鎳柱純化之后得到了純度較高的ERBS（≥95%）。

2.4 ERBS蛋白與寡核苷酸鏈的相互作用

為了分析ERBS與其對應核苷酸的特異性互作，利用鎳柱純化的ERBS和5′-FAM標記寡核苷酸（0.4μmol/L）結合ERBS后熒光強度發生改變這一特點，分析了ERBS與其目標寡核苷酸（底物）之間的解離常數（Kd）。利用0.4μmol/L的5′-FAM標記寡核苷酸鏈，分別加入不同濃度的ERBS（圖5），激發波長為494 nm，發射波長為521 nm，根據寡核苷酸鏈熒光強度的變化擬合獲得解離常數Kd。數據擬合分析發現，Kd為（9.76±0.62）nmol/L，與已發表數據（Kd≈0.5～30 nmol/L）一致。

3 結論與討論

設計可以結合任意RNA序列的PUF蛋白具有許多潛在的生物和醫學應用[26]。RNA復合體在調節基因表達方面具有很重要的作用，對多細胞真核生物的細胞分化和復雜的發育模式也是至關重要的[27-29]。但是蛋白質以何種方式結合RNA很難預測[30]，這限制了為生物技術和醫學應用設計RNA結合蛋白[31]。RBP的潛能與siRNA和miRNA相似，然而，miRNA主要是降低靶RNA在細胞質中的豐富度或表達，這依賴于RNA干擾途徑[32]。因此，設計RNA結合蛋白很吸引人，因為它們可以與任意感興趣的結構域融合，選擇性地結合于特定的RNA靶位點，進而監測或控制其代謝的任何方面。

人工設計PUF（Engineered PUF，EPUF）可以與任何靶RNA的幾個堿基特異性地結合，招募其他蛋白因子形成功能性融合蛋白，從而調控mRNA剪切，影響蛋白質翻譯和特定mRNA的穩定性。這些結果暗示，EPUF可以作為潛在的生物化學研究和生物醫療工具進行開發。

本試驗為了分析ERBS與其對應核苷酸的特異性互作，通過Escherichia coli Rosetta（DE3）表達ERBS，并利用鎳柱純化獲得ERBS，利用5′-FAM標記寡核苷酸（0.4μmol/L）結合ERBS后熒光強度發生改變這一特點，分別加入不同濃度的ERBS（激發波長為494 nm，發射波長為521 nm），根據5′-FAM標記寡核苷酸熒光強度的變化擬合獲得解離常數。

Rosetta（DE3）補充6種稀有密碼子（AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA），提高外源基因，尤其是真核基因在原核系統中的表達水平[33]。試驗也證明，使用Rosetta（DE3）之后，確實提高了蛋白的可溶性表達水平，有關如何提高外源基因可溶性表達的策略，仍需要進一步探索。