基于EST-SSR標記的西雙版納苦茶資源遺傳多樣性分析

尚衛瓊，李友勇，劉悅，段志芬，楊盛美，李慧，許燕，劉本英

（云南省農業科學院茶葉研究所，云南省茶學重點實驗室，云南省茶樹種質資源創新與配套栽培技術工程研究中心，云南昆明666201）

云南作為茶樹的原產地，具有豐富的茶樹種質資源。在茶樹種質資源收集方面，云南現在共收集保存有茶組植物31個種和2個變種，而其中作為云南特有的就有21個種[1]。張宏達[2]將茶組植物分為4個系：五室茶系、五柱茶系、禿房茶系和茶系。目前，西雙版納茶組植物共有3個系，7個種和2個變種，其中以普洱茶種（Camellia assamica）分布最廣，而苦茶（Camellia assamica var.kucha）作為其中的一個變種，經過長期的演化，其脂型兒茶素的含量遠遠高于非脂型兒茶素的含量，在制作發酵程度較高的茶類中表現出很高的優勢，蘊含著抵抗各種逆境所需要的基因，是茶樹品種中的寶貴資源。另一方面，苦茶種質資源在西雙版納傣族自治州境內有大面積分布，主要集中在勐海縣布朗山、景洪市勐龍鎮和勐臘縣易武鎮一帶。而由于西雙版納地貌多為中低山和丘陵區，茶區位置偏僻，交通不便，前人對優異茶樹種質資源的收集多集中于地方種質的收集，極大地限制了茶樹遺傳多樣性種質資源的研究和育種材料創制，有大量的茶樹資源未開展系統鑒定。

在分子鑒定方面，雖然前人對云南大葉茶資源進行了大量的研究[3-8]，但針對苦茶種質資源的研究鮮有報道，導致一些苦茶資源優良品種還沒有得到充分的開發和利用。EST-SSR技術具有成本低、通用性好、條帶清晰、帶形容易統計等優點，在茶樹遺傳多樣性、指紋圖譜、分子鑒別等研究上得到了很好的應用，是一種非常有效、可靠的分子技術[9-10]。

本研究通過利用28對SSR引物對西雙版納傣族自治州境內的50份苦茶種質資源進行EST-SSR分子標記方法遺傳多樣性和親緣關系分析，旨在初步探索西雙版納州境內苦茶種質資源的多樣性，為后期的優良種質資源收集、保護和利用提供科學參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料共50份，分別來源于西雙版納傣族自治州景洪市勐龍鎮、勐海縣布朗山鄉和勐臘縣3個地區，其中，有23份采自景洪市勐龍鎮勐宋鄉曼邁瑤村民小組，海拔1 650～1 780 m，樣品編號1～23號；15份采自勐海縣布朗山鄉老曼峨村，海拔1 650 m左右，樣品編號24～38號；12份采自勐臘縣瑤區南貢山，海拔1 470 m左右，樣品編號39～50號。利用硅膠對苦茶樣的新梢一芽二葉進行干燥處理，制成試驗樣品，并記錄樣品信息、編號，保存備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取將各份試驗材料分別進行打樣磨碎，采用改良的CTAB法[11]提取基因組DNA，利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000分光光度計測定DNA的純度和濃度，稀釋至20 ng/μL，-20℃保存備用。

1.2.2 SSR引物及PCR擴增將28對SSR引物用于樣品材料的擴增，其序列參照文獻[12]。所有引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR擴增反應在PTC-200型PCR儀上進行，反應體系為10μL，包括上下游引物各0.2μL，10×Buffer（Mg2+）1μL，dNTP 0.2μL，Taq酶0.5 U，加ddH2O至10μL。PCR反應程序為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，50～65℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環；72℃最終延伸10 min，4℃保存。PCR產物采用10%聚丙烯酰胺凝膠在電泳儀上進行電泳檢測，電壓170 V，時間120 min。銀染顯色，使用凝膠成像儀拍照記錄。

1.3 數據處理

電泳圖上的條帶處理參照張成才等[13]的方法進行，將電泳圖上的條帶由大到小按照A、B、C、D、E等依次賦值，缺失條帶以“-”表示，統計樣品材料的基因型。28對引物中的SSR07引物和SSR19引物擴增產物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜如圖1所示。

使用Popgene軟件計算每對引物的等位位點數、觀測雜合度、期望雜合度、等位基因頻率、基因型數和遺傳距離等，通過PIC-CALC 0.6計算各位點的多態性信息含量，按UPGMA軟件繪制聚類圖[14]，分析其遺傳多樣性。

2 結果與分析

2.1 不同來源苦茶資源的遺傳多樣性分析

由表1可知，28對SSR引物在50個個體中共檢測出127個等位基因，每個位點擴增出的等位基因數為3～6個，平均每個位點為4.53；Shannon信息指數為0.92～1.70，最小為SSR01位點（0.92），最大為SSR09位點（1.70），平均每個位點為1.25，除SSR01、SSR02和SSR17這3個位點的Shannon信息指數小于1外，其他位點都大于1；觀測雜合度數值為0.404～1.000，最小為SSR09位點（0.404），最大為SSR23位點（1.000），平均為0.709；期望雜合度數值為0.506～0.814，最小為SSR01位點（0.506），最大為SSR09位點（0.814），平均為0.676；多態性信息含量數值為0.444～0.777，最小為SSR01位點（0.444），最大為SSR09位點（0.777），平均為0.614。SSR17位點的等位基因數為3個，具有較低的遺傳重要性，而SSR07、SSR09這2個位點的等位基因數均為6個，說明在群體遺傳結構中具有較高的重要性。位點SSR01（0.444）、SSR02（0.476）和SSR24（0.499）的多態性信息含量在0.25～0.50，這3個位點表現為中度的遺傳多樣性，其他25個位點都大于0.5，表現為高度遺傳多樣性，表明50份供試的西雙版納苦茶資源材料具有豐富的遺傳多樣性。

表1 28個SSR位點的遺傳多樣性信息參數

2.2 不同來源苦茶資源的遺傳分化分析

表2 材料來源地間的遺傳分化

續表2

對50份西雙版納苦茶材料的不同來源地間遺傳分化進行分析，結果如表2所示，同一來源地內基因多樣性平均值為-1，且全部引物均為-1，表現為雜合體偏高；不同來源地間遺傳分化系數平均為0.803 8，表明80.38%的遺傳分化系數存在于材料不同來源地間；材料不同來源地間基因流平均為0.061 0，基因流較大，說明不同來源地間基因交流程度很高，表明本試驗中50份苦茶材料的遺傳變異多樣性主要是由不同來源地之間產生的。

2.3 聚類圖與遺傳多樣性分析

50份供試材料基于Nei's遺傳距離構建的UPGMA聚類圖如圖2所示，在大類群中，將50份苦茶資源材料分為四大類，其中，17號和22號、1號和2號各2份材料分別單獨聚為一個大類，其他的46份材料則分散分布于聚類圖中，形成2個大類。各2份供試材料均具有較大的遺傳距離和較低的遺傳相似度，5號和12號的遺傳距離最小，為0.37，相似度為0.690 8；6號和21號的遺傳距離（0.458 1）次之，相似度為0.632 5；19號和25號的遺傳距離為0.556 6，相似度為0.573 2。從整個遺傳聚類圖來看，聚類結果與多態性信息含量等參數值分析結果一致，表現出豐富的遺傳多樣性。

3 結論與討論

西雙版納苦茶資源作為一種特異資源具有重要的研究價值和利用潛力。多態性信息含量作為茶樹資源的遺傳多樣性重要指標，小于0.25時位點表現為低度多態性，大于0.25小于0.50時為中度多態性，大于0.50時為高度多態性。本研究通過利用28對SSR引物對西雙版納傣族自治州境內的50份苦茶資源進行遺傳多樣性分析，結果得出，其多態性信息含量為0.444～0.777，25對引物表現高度多態性，說明作為供試材料的50份苦茶資源具有豐富的遺傳多樣性。李丹等[15]利用ISSR分子標記分析江華苦茶群體的遺傳多樣性和親緣關系，結果表明，江華苦茶群體基因組DNA具有較高的多態性，與本研究結果相似。本研究結果也符合前人對大葉種茶和小葉種茶的研究結果[16-19]。通過聚類分析發現，50份苦茶供試材料可分為4個大類和多個亞群。親緣關系樹狀圖在分子水平上顯示了西雙版納苦茶群體各單株間的親緣關系，各2份供試茶樹資源間均具有較大的遺傳距離和較低的遺傳相似度，遺傳距離最小的為5號和12號（0.37），其相似度為0.690 8，整個遺傳圖譜表現出豐富的遺傳多樣性，可能與茶樹資源來源于不同地區有極大的關系。這與劉本英等[20-21]研究云南大葉茶和野生茶的遺傳多樣性分析結果一致。

西雙版納具有豐富的苦茶資源，其遺傳多樣性豐富，但是現階段對苦茶資源的研究甚少，苦茶資源的研究、開發及利用工作緩慢，對加快構建茶樹資源核心種質庫、分子指紋圖譜等研究具有一定的影響，為此，加快西雙版納苦茶資源的分子技術研究，發掘一批功能性成分超常量的特異資源及特色茶樹品種，篩選出有價值的特異資源和綜合性狀優良的苦茶種質資源，對保護和利用好云茶資源具有非常重要的意義。