基于熒光素酶活體成像篩選轉基因玉米植株的條件優化

常利芳，白建榮，李銳，閆蕾，郝曜山，楊瑞娟，康晨

（山西省農業科學院作物科學研究所，山西太原030031）

在植物分子生物學研究中，目的基因或啟動子的功能研究都必須通過轉基因植物純系鑒定和分析。因此，從大量的轉化后代個體中獲得高表達的轉化植株是進行這些研究的前提。用傳統方法篩選理想的轉化體及純系需要耗費大量人力、物力和財力，而應用報告基因則可以提高轉基因植株檢測的效率[1-2]。報告基因（reporter gene）通常是指應用編碼催化人工底物產生顏色變化，且表達產物容易被檢測的基因。目前，轉基因植物檢測常用的報告基因有熒光素酶基因（LUC）、β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）和綠色熒光蛋白基因（GFP）等[1-3]。這些報告基因系統中，GUS基因是通過離體染色進行鑒定，雖然成本低，但步驟多、時間長、靈敏度差，而且植物中存在內源GUS和GUS抑制子[4]。GFP和LUC基因都是通過檢測生物體中的熒光信號檢測目的基因，但GFP基因在檢測時需要激發光，雖然靈敏度高，但是信噪比低，所以，檢出效率低[3，5-8]。螢火蟲熒光素酶基因是從螢火蟲中分離出來的發光基因，該基因產生的熒光素酶與底物結合后產生酶促反應，本身可以產生熒光，不需要激發光，具有其他報告基因不可替代的優勢，即快速簡單、特異性強、無毒無放射性、靈敏度高、信噪比高等。自1986年起，螢火蟲熒光素酶基因被用作測定基因表達的報告基因，成為高效檢測基因表達和啟動子的常用方法[9-16]。

隨著分子生物學技術的發展，在不破壞生物體組織的前提下，采用活體成像技術檢測生物體的熒光信號，具有操作簡單、直觀、靈敏度高的優點，被廣泛應用于生命科學、生物醫學及藥物研發等方面[17-18]，但是作為檢測轉基因植株的手段的應用研究還比較少[16，19-20]，目前還沒有見熒光素酶基因作為報告基因在主要糧食作物轉基因植株鑒定中的應用。

本研究利用植物活體成像系統檢測玉米轉基因植株的熒光素酶基因信號，建立和優化整株轉基因植株的熒光素酶活體檢測體系，為玉米轉基因后代植株的篩選鑒定提供簡便、快速、準確、低成本的方法。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為玉米自交系鄭58和以鄭58為受體的熒光素酶轉基因T1種子，均由山西省農業科學院作物科學研究所保存。包括2017年在山西省農業科學院東陽日光溫室采用花粉管轉基因技術轉化玉米受體鄭58，共獲得轉化35S-Luciferase-NOS的T1種子66粒；轉化Ubiquitin-Luciferase-NOS的種子68粒。D-螢火蟲熒光素酶底物購自北京融京科技發展有限公司。

1.2 儀器

德國Berthold公司生產的植物活體成像系統Night SHADE LB 985采用儀器自帶的IndiGo軟件進行圖像處理及分析。

1.3 試驗方法

1.3.1 植株培養2018年6月，在山西省農業科學院分子生物共享實驗室，以玉米自交系鄭58作為對照，與T1轉基因種子一起消毒清洗后，單粒種于裝有10 mL MS培養基的50 mL離心管中，置于28℃培養箱中培養4～5 d。

1.3.2 活體成像系統檢測參數的設置將培養好的植株幼芽取出，用清水洗去根部的培養基，將幼芽放在加了碳素墨水的黑色瓊脂糖凝膠平板上，噴施15 mg/mL D-熒光素酶底物，放入Night SHADE LB985植物活體成像系統暗箱平臺，靜置反應2 min后，打開IndiGo軟件設定不同的拍照參數，拍照比較曝光時間2 min、像素合并值binning 4×4和曝光時間5 min、像素合并值binning 8×8的成像效果。

1.3.3 玉米植株的大小選擇設置3組大小的玉米植株，第1組：玉米幼芽小于1 cm；第2組：玉米幼芽3～8 cm；第3組：兩葉期的玉米幼苗。

1.3.4 成像信噪比值以植株熒光最高點的信號值作為該株的信號值，待測植株信號值與對照植株信號值均減去背景信號值后的比值作為信噪比（signal-to-noise ratio，SNR）。

2 結果與分析

2.1 活體成像系統參數的確定

由圖1可知，在曝光時間2 min、像素合并值binning 4×4時，玉米幼芽的信號最高值為124 cps，而曝光時間5 min、像素合并值binning 8×8時，幼芽的信號值為1 736 cps，靈敏度更高，適合于玉米幼芽的檢測。

2.2 確定玉米植株的大小

在曝光時間5 min、像素合并值binning 8×8條件下，分別比較了玉米芽和兩葉期幼苗的熒光信號。結果發現，在芽長小于1 cm時無法檢測到熒光信號；3～8 cm的幼芽可以檢測到明確的信號，最高值為936 cps；而兩葉期幼苗的背景信號過強，并且底物無法被葉片吸收，無法檢測到信號（圖2）。多次試驗后，最終確定28℃恒溫發芽4～5 d、3～8 cm玉米幼芽用于活體系統檢測。

2.3 根據信噪比值鑒定轉基因玉米植株

按照2.1、2.2優化后的條件對轉基因T1植株進行檢測，初篩結果顯示，轉化35S-Luciferase-NOS發芽種子66株中，11株有熒光信號；轉化Ubiquitin-Luciferase-NOS的發芽種子68株中，30株有熒光信號。進一步對這11株和30株分別進行單株復檢，其中，35S-9和35S-10信噪比值均大于2.0，分別為2.32和2.56；UB-1、UB-6、UB-11、UB-13、UB-21、UB-27信噪比分別為9.75、10.63、5.69、11.00、5.06和3.81，均大于2.0，其他植株的信噪比都小于2.0，35S-10植株的檢測結果如圖3所示。可以認為信噪比大于2.0的植株為強表達陽性植株。

3 結論與討論

螢火蟲熒光素酶基因（LUC）以不破壞植株、背景低、信噪比高等優點可作為高等植物遺傳轉化的可視化標記。熒光素酶在底物存在的條件下發生酶促反應，但前人多使用熒光檢測儀、熒光光子計數器通過體外細胞或組織發出熒光的相對熒光光子數來分析熒光素酶基因的表達情況，操作復雜，而且大量的人為操作使精確性降低[13-15]。有研究者用熒光成像儀檢測帶有熒光素酶基因的擬南芥的功能，但是只是用白光和熒光下的對比進行定性判斷，用色標度的顏色反映基因表達的強弱[19-20]。也有用色標度簡單地將有信號的植株分為無、弱、中等、強和較強5個級別進行定量分級的報道[16]。本研究表明，在曝光時間5 min、像素合并值binning 8×8條件下，以培養3～8 cm的玉米幼芽為材料，能夠較好的檢測到植株熒光素酶信號。同時，為了更加準確的判斷陽性植株，本研究引入信噪比的概念進行定量檢測，將待測植株與對照同時拍照，將二者的信號峰值分別減去背景值后的比值作為判斷標準，并確定信噪比值大于2.0的植株為強表達陽性植株。該優化的檢測體系降低了檢測的假陽性和外源基因表達較弱的植株，能夠更加準確、直觀、快速和有效的篩選玉米遺傳轉化中的陽性植株，提高轉基因植株的篩選和鑒定效率。