小麥條銹菌產(chǎn)孢轉錄組分析

張賀平

（中化化肥有限公司河北分公司，河北石家莊050031）

由條形柄銹菌小麥專化型（Puccinia striiformis f.sp.tritici，Pst）真菌引起的小麥條銹病是世界性禾谷類作物的重要病害之一，全球每年造成小麥產(chǎn)量直接經(jīng)濟損失近10億美元[1]，在我國曾發(fā)生多次大流行，嚴重危害小麥生產(chǎn)安全[2]。經(jīng)過長期不懈的努力，我國在小麥條銹病治理中取得了重大進展[3]，但由于Pst極強的變異性新型致病型不斷涌現(xiàn)，防治小麥條銹病的任務依然艱巨。

雖然不同病原菌侵染寄主所用策略不同，但最終目的都是為了獲取源自寄主的營養(yǎng)。Pst作為活體營養(yǎng)專性寄生菌，既要利用多種效應因子逃避或抑制小麥的免疫反應，又要同小麥競爭吸收糖類等營養(yǎng)物質以供應菌體生長繁殖[4]。小麥條銹菌毒性變異豐富，目前對不同毒力小麥條銹菌在侵染小麥寄主過程中差異表達基因尚未進行深入分析。

本研究選擇不同毒力小麥條銹菌（CY31、CY32、CY33和V26菌系的單孢子堆分離物），旨在通過RNA-seq技術測定Pst產(chǎn)孢時轉錄組并分析其轉錄組序列，并對差異表達基因進行探討。

1 材料和方法

1.1 材料

供試小麥條銹菌為CY31、CY32、CY33和V26菌系的單孢子堆分離物；供試小麥品種為銘賢169。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取、文庫構建及測序采用Trizol法（Invitrogen，USA）分別提取小麥條銹菌各分離物的總RNA，提取過程中所用器具和耗材均經(jīng)過DEPC處理。DNaseⅠ消化樣品中的DNA，然后用Nanodrop檢測RNA的純度和濃度，采用Agilent 2100分析儀（安捷倫公司）檢測RNA完整值（RIN），以確定RNA質量。

RNA檢測合格后，用帶有Oligo（dT）的低吸附磁珠通過A-T互補配對與mRNA的ployA尾結合的方式富集總RNA中的mRNA，隨后加入打斷試劑，按照Truseq RNA Sample Prep Kit v2說明書構建雙末端cDNA文庫。由諾禾致源公司采用Illumina HiSeqTM2000進行轉錄組測序。

1.2.2 測序數(shù)據(jù)質量控制首先檢查測序原始讀長每個堿基的測序錯誤率，采用測序Phred數(shù)值（Q值）估算堿基判別的錯誤率（通常Q10、Q20和Q30對應的堿基測序錯誤率分別為10.0%、1.0%和0.1%）；其次，為保證分析質量，必須對測序得到的原始讀長進行過濾：去除帶接頭的讀長、片段內無法確定堿基信息的比例＞10%的讀長、Q值＜20的堿基數(shù)占整個讀長50%以上的低質量讀長，得到過濾后讀長，后續(xù)分析均基于過濾后讀長進行。

1.2.3 與參考基因組序列的比對采用Tophat 2.0軟件將過濾后讀長比對到小麥條銹菌基因組（PST-78，GenBank：AJIL00000000.1）上，比對過程中允許≤2個堿基對的錯配。統(tǒng)計可定位到參考基因組上的讀長數(shù)量，其中包括在參考基因組上有多個比對位置的讀長數(shù)量以及在參考基因組上有唯一比對位置的讀長數(shù)量。如果參考基因組選擇合適，而且相關實驗不存在污染，正常情況下，定位到參考基因組上的讀長會高于70%，而有多個比對位置的讀長占總體的比例低于10%。根據(jù)過濾后讀長在參考基因組上的分布情況，總體評估獲得的測序數(shù)據(jù)在小麥條銹菌基因組上的覆蓋情況。比對到某基因的讀長若至少有1條與參考基因匹配，則將該參考基因定義為一個表達基因。

1.2.4 基因表達譜分析和差異基因注釋基因表達水平與其轉錄本的豐度相關，通常轉錄本豐度越高，則基因表達水平越高。讀長數(shù)量除了與基因的真實表達水平相關外，還受測序深度和基因長度的影響。為減小這種影響，轉錄組基因表達量以FPKM（Fragments Per Kilobase per Millions base pairs sequenced）值來衡量。FPKM同時考慮了測序深度和基因長度對讀長數(shù)量的影響，是目前常用的基因表達水平估算方法。

由于本試驗沒有設置生物學重復，因此，先采用DEGseq軟件的TMM程序對讀長計數(shù)的數(shù)據(jù)進行標準化處理，然后用cufflinks軟件統(tǒng)計小麥條銹菌兩兩樣品間基因的表達差異狀況，再通過多重假設檢驗（False discovery ratio，F(xiàn)DR）對計算出的每一差異表達基因的P值進行校正。為消除生物學變異，閾值設定為樣品間FPKM比值2倍以上且FDR＜0.005，同時滿足差異倍數(shù)和顯著水平的基因作為差異表達基因。將差異表達基因和NCBI nr數(shù)據(jù)庫進行比對，用nr注釋庫中同源基因的注釋信息代表差異表達基因的注釋信息。采用KOBAS軟件將差異表達基因與KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得差異表達基因相對應的路徑注釋信息。

2 結果與分析

2.1 RNA和測序數(shù)據(jù)質量評估

用Trizal法提取小麥條銹菌CY31、CY32、CY33和V26菌系的RNA后，質量檢測顯示，OD260/OD280值在1.902～1.942，RIN值在9.5～9.7，25S/18S比值均為1.6，濃度范圍在468～540 ng/μL。表明所用樣品的RNA純度和完整性較好，可滿足轉錄組測序要求。

分析原始讀長堿基的測序錯誤率和Q值分布，可以檢測測序數(shù)據(jù)的質量。測序錯誤率受多因素影響，轉錄組的測序錯誤率具有2個特點：一是隨著測序讀長長度增加測序錯誤率升高；二是讀長端的前6個堿基位置測序錯誤率較高。前者是由于測序過程中化學試劑消耗而導致的，后者是因為隨機引物和RNA模板不完全結合，而這6個堿基位置恰好是文庫構建時反轉錄中隨機引物的位置。一般樣品的讀長中每個堿基測序錯誤率應該低于0.5%。CY31、CY32、CY33和V26菌系測序過程堿基錯誤率均低于0.02%（表1）。除了堿基的測序錯誤率外，堿基的質量也是RNA-Seq測序質量評估的一個重要指標，一般Q30在80%以上的測序質量非常可靠。本研究4個樣品的Q20均在95.63%以上，Q30在89.79%以上（表1）。表明轉錄組測序得到的質量結果可靠，可用于后續(xù)分析。

表1 小麥條銹菌轉錄組測序數(shù)據(jù)評估統(tǒng)計

小麥條銹菌CY31、CY32、CY33和V26菌系轉錄組共產(chǎn)生396 711 824條原始讀長，經(jīng)過濾后獲得382 125 418條過濾后讀長，每個樣品均獲得了13.23 Gb以上的堿基（表1）。將過濾后讀長與小麥條銹菌PST-78菌系參考基因組分別比對，4個樣品序列的71.15%以上讀長可以比對到參考基因組（PST-78，GenBank：AJIL00000000.1）（表2）。其中，CY31、CY32、CY33和V26菌系唯一比對到參考基因組的讀長占總過濾后讀長的比例依次為73.03%、70.14%、73.13%和70.16%，多處比對到參考基因組的讀長占總過濾后讀長的百分比在0.99%～1.16%（表2），遠低于10%。此外，定位到參考基因組外顯子區(qū)及內含子區(qū)的讀長數(shù)量占定位到參考基因組上的讀長的比例顯示，定位到外顯子區(qū)的讀長的比例最高，CY31、CY32、CY33和V26菌系對應的比例分別是60.8%、73.9%、57.5%和76.4%，定位到內含子區(qū)域的讀長的比例最低，4個樣品對應的比例均低于0.3%，從基因覆蓋度的角度也證實，轉錄組數(shù)據(jù)已覆蓋參考基因組上大部分基因。本研究所得轉錄組測序數(shù)據(jù)結果能反映小麥條銹菌菌系的整個轉錄組，這些測序數(shù)據(jù)的質量、數(shù)量評估為后續(xù)的基因表達差異分析奠定了基礎。

表2 小麥條銹菌轉錄組數(shù)據(jù)與參考基因組比對統(tǒng)計 條

2.2 基因表達譜及差異表達基因分析

轉錄組的讀長數(shù)量可以定性地評估基因的表達情況，通過轉換計算出FPKM值則可以對多個基因表達水平進行比較。統(tǒng)計CY31、CY32、CY33和V26菌系不同表達水平的基因數(shù)量，結果顯示，轉錄組FPKM值小于10的基因數(shù)分別占對應文庫的74.73%、75.86%、74.94%和75.07%（表3），10＜FPKM值＜100時，基因數(shù)分別占21.57%、20.63%、21.32%和21.37%，其中，F(xiàn)PKM值大于60的基因數(shù)所占比例均低于7.0%，而FPKM值大于10 000的基因在CY31、CY32、CY33和V26菌系樣品文庫中分別有7、8、7、7個。為了檢測不同毒力小麥條銹菌基因的表達差異狀況，將|log2Fold change|≥1且FDR＜0.005作為顯著差異表達基因的2個維度，從差異倍數(shù)和顯著水平2個水平評估小麥條銹菌樣品間差異表達基因，小麥條銹菌CY31、CY32、CY33和V26菌系間差異表達基因數(shù)目如表4所示，小麥條銹菌V26 vs.CY31、V26 vs.CY32、V26 vs.CY33間差異表達基因數(shù)量依次為35、4、52個，CY32 vs.CY31、CY32 vs.CY33、CY33 vs.CY31間差異表達基因數(shù)量最大不超過10個。各基因表達的差異倍數(shù)比較均一，差異水平變化主要集中在6倍以內，差異倍數(shù)最大的一個基因為13倍（V26 vs.CY33中的差異基因）。分析發(fā)現(xiàn)，小麥條銹菌CY31、CY32、CY33、V26菌系產(chǎn)孢時不但差異表達基因較少，而且在不同菌系間往往出現(xiàn)相同的差異表達基因。例如，V26 vs.CY31發(fā)現(xiàn)35個差異表達基因，其中，上調基因25個、下調基因10個，上調基因中16個與V26 vs.CY33的上調基因相同，下調基因中8個與V26 vs.CY33的下調基因相同；V26 vs.CY32發(fā)現(xiàn)有4個差異表達基因（均為上調表達）與V26 vs.CY33間的上調基因相同，其中的一個差異表達基因（PSTG_14209）在V26 vs.CY31、V26 vs.CY32、V26 vs.CY33的上調差異基因中均被發(fā)現(xiàn)。CY31 vs.CY33發(fā)現(xiàn)的3個差異表達基因（2個上調、1個下調）與CY32 vs.CY31的相同。而CY32 vs.CY33的差異表達基因有所不同，發(fā)現(xiàn)的3個差異表達基因與CY32 vs.CY31、CY33 vs.CY31的差異表達基因均不同。

表3 小麥條銹菌不同表達水平區(qū)間的基因數(shù)量 個

表4 小麥條銹菌菌系間產(chǎn)孢時差異表達基因數(shù)量 個

將已注釋的差異表達基因與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，結果表明，共有53個基因被注釋到了KEGG中的36個通路中，其中，顯著富集通路（P＜0.05）有5個（表5）。顯著富集通路主要參與到氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）、RNA降解（RNA degradation）、真核生物核糖體合成（Ribosome biogenesis in eukaryotes）、淀粉和糖代謝（Starch and sucrose metabolism）、內質網(wǎng)蛋白加工（Protein processing in endoplasmic reticulum）等通路中。可見，小麥條銹菌CY31、CY32、CY33和V26菌系間產(chǎn)孢時在糖類的代謝、磷酸化等方面變化明顯，說明小麥條銹菌產(chǎn)孢受糖代謝系統(tǒng)的調節(jié)。

表5 小麥條銹菌差異基因注釋

3 結論與討論

本研究結果表明，4個小麥條銹菌分離物間產(chǎn)孢時差異表達基因數(shù)量較少，而且在不同菌系間往往出現(xiàn)相同的差異表達基因。例如，V26 vs.CY31發(fā)現(xiàn)35個差異表達基因（上調表達25個、下調表達10個），其上調表達基因中有16個與V26 vs.CY33的上調基因相同，下調基因中有8個與V26 vs.CY33的下調基因相同。

功能注釋顯示，Pst分離物間差異表達基因主要集中在糖和淀粉代謝及氧化磷酸化路徑中。本研究發(fā)現(xiàn)，編碼糖原脫支酶和磷酸葡萄糖變位酶的直 系同源基因PSTG_05529、PSTG_09692在4個Pst分離物與小麥親和互作中表達差異顯著。糖原脫支酶催化糖原分解并釋放1分子葡萄糖，而磷酸葡萄糖變位酶是糖原分解及其逆反應糖原合成中共存的催化酶，可以催化葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖-6-磷酸相互轉化，2種酶在糖代謝中具有重要的作用。

比較基因組發(fā)現(xiàn)，病原菌基因組編碼產(chǎn)物的類型和數(shù)量與其寄生方式緊密相關，例如，活體寄生菌中編碼細胞壁降解酶的基因比其他營腐生類型的少，小麥條銹菌基因組的特征更加顯著，其基因組中缺乏編碼同化N、S必需酶的基因，而編碼糖類和氨基酸轉運蛋白的基因數(shù)量極大增加[5-7]，基因組結構表明，小麥條銹菌生長依賴吸收源自寄主的糖類等營養(yǎng)。糖類既能提供能量，又能作為信號分子影響糖運輸方向、寄主抗病性等廣泛的細胞反應。

多項研究結果表明，成功侵染的細菌、真菌和卵菌等病原菌調節(jié)寄主植物的SWEET基因大量表達，增加外流到受侵染寄主質外體中的糖含量以供病原菌吸收。病原菌操縱寄主的糖轉運蛋白，只是穩(wěn)定獲取源自植物糖類的第1步，隨后需要將糖類從植物質外體吸收進入菌體的細胞質，這一過程可能需要病原菌自身編碼的蔗糖酶類分解酶和糖轉運蛋白的參與。蔗糖酶主要功能是將蔗糖水解成葡萄糖和果糖，例如，青楊葉銹菌（Melampsora larici-populina）和小麥稈銹菌（Puccinia graminis f.sp.tritici）侵染各自的寄主過程中蔗糖酶基因均上調表達[7]。最近發(fā)現(xiàn)的Pst基因組中編碼蔗糖酶的PsINV基因可以高效分解蔗糖，并且在Pst與小麥的親和與非親和反應中均大量表達[8]。侵染過程中蔗糖酶基因表達量增加，可能將質外體中的蔗糖分解成容易吸收的葡萄糖和果糖等己糖，同時表明，這些病原菌編碼的糖轉運蛋白對己糖底物親和力比較高。此外，多項研究表明，病原菌自身編碼的糖轉運蛋白在與寄主糖轉運蛋白爭奪糖的過程中發(fā)揮著重要作用。例如，蠶豆銹菌（Ustilago fabae）編碼的HXT1轉運蛋白專化性吸收葡萄糖和果糖[9]，灰霉菌（Bortrytis cinerea）編碼的Frt1轉運蛋白對果糖高親和。在玉米黑粉菌（Ustilago maydis）中發(fā)現(xiàn)了19個糖轉運蛋白，其中，己糖轉運蛋白Hxt1底物較廣泛，與玉米競爭糖類時對葡萄糖具有高親和力，也可以轉運果糖和甘露糖[10-11]。蔗糖轉運蛋白UmSrt1具有底物專一性，其對蔗糖親和力比玉米的蔗糖轉運蛋白ZmSUT1高200倍，敲除UmSrt1極大降低了病原菌的毒性，同時敲除UmSrt1和Hxt1的菌株致病性和寄生適合度均強烈降低，表明Ustilago maydis侵染過程需要同時吸收果糖和葡萄糖，Ustilago maydis既能吸收蔗糖也能吸收己糖，對在多種生境下與玉米爭奪糖類具有極大優(yōu)勢[10，12-13]。寄主植物在和病原菌競爭糖類的過程中進化出相反的糖轉運機制，寄主植物在免疫系統(tǒng)激發(fā)下調節(jié)STP類己糖轉運蛋白將糖從質外體回收，降低質外體中糖含量限制病原菌獲取糖類。例如，擬南芥的己糖轉運蛋白基因STP13受Pseudomonas syringae、Bortrytis cinerea或白粉菌侵染激活表達，調節(jié)受侵染擬南芥質外體中己糖轉運到細胞質，從而限制侵入到擬南芥質外體中的病原菌獲取糖類營養(yǎng)[14-15]。葡萄受到活體專性寄生菌白粉菌和霜霉菌侵染時，己糖轉運蛋白STP13類直系同源基因VvHT5上調表達，致使質外體中糖含量降低，限制了病原菌擴散[16]。這些結果說明植物的己糖轉運蛋白在植物防御中具有重要作用。

本研究在Pst基因組中發(fā)現(xiàn)預測編碼葡萄糖轉運蛋白的基因，但未發(fā)現(xiàn)預測編碼果糖轉運蛋白的基因。一方面顯示糖轉運蛋白對Pst獲取糖類具有重要影響，另一方面表明Pst吸收糖類機制與已知的其他活體寄生菌有顯著不同[17]。

轉錄數(shù)據(jù)提供的僅是相關線索，如果要明確差異表達基因的確切功能，需要進行遺傳、分子以及生理功能等的綜合深入分析。