在線固相萃取凈化-高效液相色譜法測(cè)定人血漿中的霉酚酸

許澤君，景 霞*，孫 芳，吉 超*，楊新磊

(1.南京醫(yī)科大學(xué) 附屬兒童醫(yī)院，江蘇 南京 210008；2.安捷倫科技(中國(guó))有限公司，上海 200080 )

嗎替麥考酚酯(Mycophenolate mofetil,MMF)是一種腎移植時(shí)常用的免疫抑制劑[1]，在進(jìn)入人體后快速水解成霉酚酸而發(fā)揮藥效[2]。近年來(lái)，該藥被發(fā)現(xiàn)在治療腎病綜合癥方面也有著良好的應(yīng)用前景，并且由于其腎毒性較小，在兒科臨床上使用日益增多[3-5]。有研究表明，在固定劑量下，成人體內(nèi)的藥物暴露量有很大差異，個(gè)體間藥代動(dòng)力學(xué)差異甚至大于10 倍[6]，再加上該藥的服用療程較長(zhǎng)，這種差異可能造成療效不足或者不良反應(yīng)[1,3-5]。為保證合理用藥[7]，進(jìn)行霉酚酸的血藥濃度監(jiān)測(cè)十分必要。

酶放大免疫法(EMIT)[8-9]、高效液相色譜法(HPLC)[10-13]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[14-15]是常用的3種血藥濃度檢測(cè)手段。其中，酶放大免疫法快速方便，但特異性較差，代謝物會(huì)產(chǎn)生免疫交叉反應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)果正偏離[16]，且所用試劑盒較為昂貴。高效液相色譜法中，由于血漿含有大量的蛋白和磷脂等大分子雜質(zhì)，需要對(duì)血樣進(jìn)行復(fù)雜的前處理后才能進(jìn)樣分析，造成時(shí)間、人力及試劑的消耗較大，且還會(huì)引入誤差。LC-MS/MS同樣涉及復(fù)雜的樣品前處理，且儀器采購(gòu)與成本維護(hù)昂貴，對(duì)操作人員的要求較高。基于醫(yī)院臨床的大樣本和時(shí)效性等特點(diǎn)，傳統(tǒng)的液液萃取、離線固相萃取等方法由于其步驟繁瑣、重現(xiàn)性欠佳等局限性，不適用于醫(yī)院檢測(cè)。而在線固相萃取(Online SPE)是一種基于閥切換的自動(dòng)化樣品前處理技術(shù)，具有分析快速、操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、易于聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn)。本方法使用限進(jìn)介質(zhì)填料的萃取柱,自動(dòng)化去除經(jīng)蛋白沉淀后樣品中的少量殘余蛋白與磷脂，以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的富集與凈化。進(jìn)一步將Online SPE與HPLC 聯(lián)用則可克服HPLC靈敏度不足、干擾較大的局限性，在臨床血藥濃度檢測(cè)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景，已用于茶堿[17]、左旋舒必利[18]、氨磺必利[19]等藥物的血藥濃度監(jiān)測(cè)。本文建立了Online SPE-HPLC聯(lián)用測(cè)定血漿中霉酚酸濃度的分析方法，減少了分析步驟和人為因素引入的誤差，節(jié)省了試劑消耗，可以滿足醫(yī)院臨床監(jiān)測(cè)的需求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Online SPE-HPLC系統(tǒng)購(gòu)自安捷倫公司，包括一維模塊(G7111A泵、G7167自動(dòng)進(jìn)樣器、G7167B柱溫箱和G7114A檢測(cè)器)和二維模塊(G7120A泵、G7117B 二極管陣列檢測(cè)器和G1170A雙二位四通閥)；十萬(wàn)分之一分析天平(MS205DU，瑞士Mettler Toledo公司)；Vortex-5渦旋振蕩器(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司);Abbott離心機(jī)( 德國(guó)Hettich公司)。

霉酚酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于98%,Lot.086M4010V,Sigma公司);甲醇、乙腈(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；純化水采用二級(jí)反滲透裝置純水系統(tǒng)(南京慧城水處理設(shè)備有限公司)自制。空白血漿由南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院提供。

1.2 樣本的制備

圖1 Online SPE系統(tǒng)連接示意圖

精密稱取霉酚酸標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg至25 mL容量瓶，加甲醇至刻度后，超聲2 min。置于-30 ℃冰箱內(nèi)保存。用空白血漿稀釋至目標(biāo)濃度后，取200 μL置于1.5 mL 離心管中，加入甲醇400 μL，渦旋振蕩5 min后，10 800 r/min離心8 min，取上清液，進(jìn)樣檢測(cè)。

1.3 液相色譜與在線固相萃取條件

固相萃取柱：Capcell PAK MF Ph-1(4.6 mm×10 mm)；分析柱：Poroshell 120? EC-C18柱(4.6 mm×50 mm，2.7 μm)。1D泵流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.5%磷酸水溶液，梯度洗脫，流速為1.0 mL/min；2D泵流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%三乙胺溶液(10%磷酸調(diào)節(jié)pH至3.5±0.1)，流速為0.8 mL/min；柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm，進(jìn)樣量20 μL。

Online SPE系統(tǒng)連接如圖1所示。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，0～2.0 min，切換閥處于1～3連接狀態(tài)，1D泵將樣品上樣至固相萃取柱，樣品中的霉酚酸在固相萃取柱中保留，而蛋白等大分子物質(zhì)不保留，直接流入廢液；2.0～2.5 min，切換閥處于1～7連接狀態(tài)，2D泵流動(dòng)相將霉酚酸從固相萃取柱轉(zhuǎn)移至分析柱；2.5～9.0 min，切換閥處于1～3連接狀態(tài)，1D泵沖洗固相萃取柱并將流動(dòng)相平衡至初始狀態(tài)，分析泵繼續(xù)完成霉酚酸的分離和沖洗平衡，具體洗脫程序和閥切換參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 在線固相萃取、分析洗脫及閥切換的程序

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品制備條件的優(yōu)化

在線固相萃取雖可去除血漿中的蛋白，但將血漿直接進(jìn)樣，會(huì)由于蛋白含量過(guò)高，影響萃取柱的壽命和方法的穩(wěn)定性。因此在樣品制備過(guò)程中，先加入有機(jī)溶劑沉淀去除大部分蛋白，再進(jìn)行固相萃取及分析。考察了常用有機(jī)蛋白沉淀試劑甲醇及乙腈對(duì)樣品中蛋白的去除效果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)乙腈處理后的樣品溶液經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間放置或者冷藏后會(huì)再次析出蛋白，可能會(huì)造成萃取小柱堵塞。因此實(shí)驗(yàn)選擇甲醇作為最佳蛋白沉淀試劑。

此外，樣品制備時(shí)，樣品-甲醇的體積比也會(huì)影響血漿中蛋白沉淀的效率。隨著甲醇比例的增加，沉淀效率略有提高，但同時(shí)也會(huì)稀釋樣品中的霉酚酸濃度。考慮到在線固相萃取中還會(huì)進(jìn)一步去除蛋白，為了保證方法的靈敏度，本實(shí)驗(yàn)選擇樣品-甲醇的體積比為1∶2。

2.2 固相萃取條件的優(yōu)化

固相萃取主要目的是純化樣品，在去除血漿中蛋白質(zhì)等大分子的同時(shí)，保留藥物小分子。常規(guī)的反相色譜柱對(duì)大分子蛋白具有一定的保留作用，而高有機(jī)相比例會(huì)造成蛋白質(zhì)析出，長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致柱頭堵塞，使用壽命縮短。限進(jìn)介質(zhì)色譜柱是近年發(fā)展起來(lái)的新型色譜柱，其通過(guò)尺寸排阻、鍵合長(zhǎng)鏈親水基團(tuán)等手段，達(dá)到降低大分子蛋白在柱內(nèi)保留的效果，可有效去除樣品中殘余的蛋白，并保留小分子藥物。該類萃取柱的鍵合相類型較多，如反相C18、C8、苯基、離子交換等。不同的鍵合相具有不同的化合物選擇性。本實(shí)驗(yàn)中，由于目標(biāo)物霉酚酸具有苯環(huán)共軛結(jié)構(gòu)，能與苯基柱中的苯環(huán)鍵合相產(chǎn)生Π-Π相互作用，從而形成較好的特異性吸附。此外，苯基柱的反相保留能力比C18弱，將霉酚酸從苯基柱上洗脫時(shí)有機(jī)相比例無(wú)需太高，進(jìn)入C18分析柱時(shí)可再次產(chǎn)生柱頭富集效果，避免產(chǎn)生溶劑效應(yīng)，使目標(biāo)物峰形更加尖銳。綜上考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇苯基型的Capcell PAK MF Ph-1作為萃取柱。該柱不僅純化效果好，而且可重復(fù)使用千次以上[19]。

圖2 霉酚酸在1D檢測(cè)器的色譜圖(不切換)

由于固相萃取流動(dòng)相的選擇會(huì)直接影響蛋白的去除效果及目標(biāo)物的保留，本實(shí)驗(yàn)中，目標(biāo)物霉酚酸具有羧基及酚羥基兩個(gè)易電離基團(tuán)，因此選擇在固相萃取的水相中加入0.5%磷酸，使流動(dòng)相呈酸性，以抑制霉酚酸的電離，增強(qiáng)其在萃取柱上的保留，具體流動(dòng)相選擇見(jiàn)“1.3”。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)流動(dòng)相中甲醇比例為20%時(shí)，樣品中的蛋白可快速通過(guò)萃取柱，霉酚酸在固相萃取柱的保留時(shí)間可達(dá)3.7 min左右(見(jiàn)圖2)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇2 min時(shí)切換閥，能保證蛋白質(zhì)已完全洗脫去除，而霉酚酸仍保留在萃取柱中。在2.5 min閥切回時(shí),1D檢測(cè)器未檢出霉酚酸的信號(hào)，表明霉酚酸均已進(jìn)入分析柱(圖3)。

圖3 2～2.5 min閥切換時(shí)，1D()和2D()檢測(cè)器的色譜圖

2.3 分析條件的優(yōu)化

2.3.1 流動(dòng)相的優(yōu)化比較了乙腈、甲醇作為有機(jī)相以及pH值不同(pH 3.5、6.5)的水相等不同流動(dòng)相組成對(duì)霉酚酸峰形和響應(yīng)的影響。結(jié)果表明，以乙腈為有機(jī)相時(shí)，霉酚酸的響應(yīng)明顯高于甲醇；由于霉酚酸易電離，需要較低pH值產(chǎn)生抑制，因此選擇pH 3.5的水相時(shí)能得到更好的峰形；為了進(jìn)一步提高峰形的對(duì)稱性，實(shí)驗(yàn)選擇加入0.1%三乙胺抑制霉酚酸拖尾，并選擇了水相與有機(jī)相的比例為65∶35，以獲得適中的保留時(shí)間。

2.3.2 波長(zhǎng)的優(yōu)化對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)霉酚酸在215 nm 和254 nm附近均有較強(qiáng)的吸收光譜，且以215 nm處的響應(yīng)更高，因此實(shí)驗(yàn)選擇215 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4 分析方法的評(píng)價(jià)

2.4.1 專屬性在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，分別處理空白血漿和含霉酚酸的血漿，進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，霉酚酸在分析柱中的保留時(shí)間為5.7min，與空白血漿相比，無(wú)血漿內(nèi)源性物質(zhì)干擾，且峰形良好(圖4)。

圖4 空白血漿(A)和加標(biāo)血漿樣品(B)的色譜圖

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與定量下限以血漿為基質(zhì)，配制霉酚酸質(zhì)量濃度分別為0.20、0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00 μg/mL的系列基質(zhì)加標(biāo)樣品。以霉酚酸的峰面積(Y)和對(duì)照品質(zhì)量濃度(X，μg/mL)作線性回歸，得到回歸方程為Y=58.16X+1.58，r=0.999 8。定量下限(S/N=10)為0.20 μg/mL，檢出限(S/N=3)為0.07 μg/mL。

2.4.3 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差配制0.39、25.00、50.00 μg/mL高、中、低3 種霉酚酸質(zhì)量濃度的血漿樣品，每種濃度1 d 內(nèi)按“1.3”方法平行操作5次，連續(xù)測(cè)定3 d。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察對(duì)照品的加標(biāo)回收率及日內(nèi)、日間精密度。測(cè)得霉酚酸的日內(nèi)回收率為98.0%～105%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Intra-RSD)為2.6%～3.1%，日間回收率為96.2%～104%，日間RSD(Inter-RSD)為2.9%～3.3%，方法的準(zhǔn)確度與精密度均良好(表2)。

表2 血漿樣品中霉酚酸的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.4.4 方法的穩(wěn)定性考察了含高、中、低3 種質(zhì)量濃度(0.39、25.00、50.00 μg/mL)霉酚酸的血漿樣品在不同溫度條件下(室溫放置6 h、4 ℃冰箱放置12 h、反復(fù)凍融3次)的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，霉酚酸在上述3種溫度條件下的RSD為1.3%～5.8%，表明霉酚酸在這3種條件下基本穩(wěn)定(表3)。

表3 加標(biāo)血漿樣品中霉酚酸的穩(wěn)定性

表4 5例患者的霉酚酸測(cè)試結(jié)果

2.5 臨床應(yīng)用

采集5例服用嗎替麥考酚酯的待測(cè)患者0、0.5、2.0 h后的血樣，高速離心后取血漿按本方法對(duì)霉酚酸的質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測(cè)(C0 h、C0.5 h、C2.0 h)。結(jié)果顯示(見(jiàn)表4)，霉酚酸的質(zhì)量濃度均在線性范圍內(nèi)。通過(guò)有限采樣法可以計(jì)算霉酚酸在患者體內(nèi)的暴露量(AUC0-12 h)[20]，以評(píng)價(jià)霉酚酸的吸收程度及其在體內(nèi)的暴露特性，從而供臨床參考。

3 結(jié) 論

本研究建立了血漿中霉酚酸的在線樣品前處理-高效液相色譜分析方法。本方法樣本前處理簡(jiǎn)便，分析過(guò)程高效快速，準(zhǔn)確度和精密度良好，為臨床開(kāi)展霉酚酸的血藥濃度監(jiān)測(cè)提供了適宜的分析方法。