水凝膠涂覆紙噴霧離子化用于生物流體樣品直接質譜分析

何元毅，詹柳娟，黃光明

(中國科學技術大學 化學與材料科學學院，安徽 合肥 230026)

紙噴霧離子源(Paper spray ionization,PSI)[1]作為敞開式大氣壓離子源(Ambient ionization)技術之一，已被廣泛應用于檢測生物流體中的藥物及其代謝物[2-3]、蛋白質[4]、食品與環境中的污染物[5]和細菌中脂質[6-7]等。PSI具有集采樣、樣品分離和離子化于一體的獨特優勢，大大地簡化了質譜分析步驟，提高了樣品分析速度；紙基質具有色譜層析作用，可有效地減少離子抑制和基質效應；紙具有多孔性結構，不會造成堵塞，可直接分析液態和固態復雜樣品；紙基質環境友好，生物相容性好，便于生物樣品的儲存運輸；裝置簡單，便于和微型質譜儀聯用。然而，在分析復雜生物樣品時，由于基質效應的影響，紙噴霧質譜的檢測性能仍然會大打折扣[8]。

近年來，許多研究工作致力于在紙噴霧質譜中聯用如免疫分析[9-11]、固相萃取/固相微萃取(SPE/SPME)[12-13]和液液萃取[14]等凈化富集技術以提升方法性能。PSI-MS與免疫技術聯用，利用免疫反應的特異性結合，可實現高選擇性富集被分析物，具有其他方法難以替代的優勢。PSI-MS與固相萃取/固相微萃取技術聯用，可將被分析物富集在固定相上，提升選擇性和靈敏度，無需制備反應，重現性較好。PSI-MS與液液萃取技術聯用，可將萃取溶劑作為噴霧溶劑，實現微量樣品的在線萃取、分析，降低樣品基質復雜性，提高分析精確度和靈敏度。其對樣品量要求小，使用一次性材料，無需清洗步驟，具有較好的實用性。Damon等[14]在疏水化處理的紙基質上，實現了4 μL生物樣品的在線液液萃取和定量分析。PSI-MS與液液萃取聯用，使用疏水化處理[15-18]的紙，樣品擴散作用弱，易實現液液萃取；使用乙酸乙酯作為噴霧溶劑，其與生物樣品互不相溶，對于弱極性物質具有較好的萃取和離子化效果[19]。然而，乙酸乙酯在紙基質上擴散嚴重，導致蒸發速度過快，萃取效率低且噴霧時間短，降低了信號強度[20-21]。因此，PSI-MS與液液萃取的聯用需發展一種噴霧時間長，且能提高被分析物的質譜信號強度的方法。

本研究提出一種水凝膠涂覆紙噴霧離子化的方法。瓊脂糖在紙表面發生物理交聯，形成具有三維網絡結構的水凝膠[22]。水凝膠具有限制溶液擴散的作用[23]，在水凝膠涂覆的紙基質上滴加的溶液，可在一定時間內保持液滴狀態，減少揮發面積。在瓊脂糖涂覆的紙基質表面滴加互不相溶的生物流體樣品液滴和噴霧溶劑液滴，即可實現更有效的液液萃取，延長信號持續時間的同時，提高質譜檢測靈敏度。本方法材料制作簡單，分析方法快速，且無需前處理，可直接快速完成微量生物流體樣品中治療藥物的定量分析。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

卡馬西平、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基嘧啶、阿替洛爾、兔全血、瓊脂糖購自Sangon Biotech公司；普萘洛爾、卡馬西平10，11-環氧化合物購自阿拉丁公司；阿米替林、阿米替林-D6、甲醇(純度≥99.9%)購于百靈威公司；乙酸乙酯(純度≥99.5%)購自國藥集團；人尿樣來自實驗室志愿者；實驗用水為去離子水(美國Millipore超純水儀制備)；色譜紙為Whatman 1 CHR(200 mm×200 mm)。其中，阿米替林-D6、普萘洛爾、卡馬西平10，11-環氧化合物、磺胺甲基嘧啶分別為阿米替林、阿替洛爾、卡馬西平和磺胺二甲基嘧啶的內標物。

1.2 紙基質制備

水凝膠涂覆紙基質制備：將色譜紙浸入60 ℃ 2%瓊脂糖水溶液中，使兩面覆蓋均勻，將紙懸掛在通風櫥晾至表面干燥，剪成高10 mm，寬8 mm的等腰三角形，折疊成如圖1A所示形狀，備用。

常規紙噴霧紙基質制備：將未經修飾的色譜紙剪成高10 mm，寬8 mm的等腰三角形，備用。

1.3 紙噴霧分析

水凝膠涂覆紙噴霧裝置如圖1B所示，將制備好的水凝膠涂覆紙基質置于質譜口約5 mm處，滴加4 μL樣品和8 μL乙酸乙酯呈液液萃取狀態，在紙基質表面施加3 kV直流高壓，形成噴霧，產生的噴霧液滴最終進入質譜。常規紙噴霧質譜使用色譜紙，其他參數同水凝膠涂覆的紙噴霧質譜。定量分析時紙噴霧質譜方法使用4 μL樣品和15 μL甲醇。

阿米替林的質譜定量分析使用LTQ Orbitrap XL(Thermo Fisher Scientic,San Jose,CA,USA)進行測定,其余紙噴霧質譜實驗均使用LTQ Velos雙壓線性離子阱質譜儀(Thermo Fisher Scientic)進行測量。所有譜圖均為正離子模式，質譜儀毛細管入口溫度設置為275 ℃，紙噴霧所加高壓設定為3 kV。通過碰撞誘導解離(CID)能量獲得的串聯質譜(MS/MS)譜圖用于分析，碰撞誘導解離的能量設置為35%，m/z隔離寬度為2.0。卡馬西平m/z237.2→194.1，卡馬西平10，11-環氧化合物m/z253.0→236.1，阿替洛爾m/z267.2→190.1，普萘洛爾m/z260.2→183.1，磺胺二甲基嘧啶m/z279.2→186.0，磺胺甲基嘧啶m/z265.2→172.1，阿米替林m/z278.1→233.2，阿米替林-D6m/z286.1→233.2。離子注入時間設定為10 ms，所得信號為3次掃描的平均信號。

圖1 水凝膠涂覆紙噴霧裝置圖、簡圖及噴霧圖

2 結果與討論

2.1 水凝膠涂覆紙噴霧過程

樣品和乙酸乙酯在水凝膠涂覆的紙基質上被固定在紙張的前半部分區域，難以向后擴散，形成液液萃取，最終潤濕紙張(圖1B)。水凝膠涂覆紙噴霧萃取待測物及待測物離子化過程如圖1C所示。由于水凝膠網絡內部富含水分子，導電性能好，沒有全部潤濕的紙張仍可導電，并形成穩定的噴霧。噴霧過程如圖1所示，先滴加樣品和乙酸乙酯形成液液萃取(圖1D)，接通電壓即形成噴霧(圖1E)，短暫時間后持續形成穩定噴霧(圖1F)，直至乙酸乙酯全部消耗(圖1G)。

2.2 分析尿樣中藥物提升信號強度并延長噴霧時間

本方法采用水凝膠涂覆紙基質，使乙酸乙酯維持液滴形式，減少其揮發面積，以減慢揮發速度，延長萃取和噴霧時間。生物流體樣品在水凝膠涂覆紙基質的表面也呈現為液滴形態，與乙酸乙酯僅在表面相接觸，從而實現高效的液液萃取(圖1C)。因此，水凝膠涂覆紙噴霧能延長噴霧時間，提升質譜信號。為評估該方法，對比了人尿液中卡馬西平的常規紙噴霧和水凝膠涂覆紙噴霧檢測。將含有500 ng/mL卡馬西平的尿液在2種離子源中分別進樣分析，比較MS/MS特征離子峰信號強度和噴霧時間差異(圖2)。結果顯示，與常規紙噴霧相比，水凝膠涂覆紙噴霧信號提升100倍，噴霧時間延長近10倍。使用8 μL乙酸乙酯時，與常規紙噴霧質譜噴霧時間僅為0.12 min相比，水凝膠涂覆紙噴霧質譜噴霧時間可達0.94 min。

2.3 實驗條件優化

為獲得水凝膠紙噴霧的最佳操作參數，實驗以人尿液中的卡馬西平(500 ng/mL，4 μL)為樣品，對電壓、噴霧溶劑用量和種類等參數進行了優化。

電壓對紙噴霧質譜的信號強度有較大影響，若電壓過低，不能形成噴霧或噴霧不穩定，質譜信號低；電壓過高，噴霧會形成cone-jet模式[24]，且易發生放電現象，穩定信號時間短。考察了不同電壓(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 kV)對卡馬西平離子強度的影響。結果顯示，施加2.5 kV電壓時噴霧太小，分析物信號幾乎觀察不到；施加3.0～3.5 kV電壓時信號較好；施加4.0 kV以上電壓時，會形成cone-jet模式，卡馬西平的信號降低。因此，將水凝膠涂覆紙噴霧質譜施加電壓設定在3.0～3.5 kV。

噴霧溶劑用量也會對質譜信號強度產生較大影響。相對于樣品量，若噴霧溶劑用量太多會有顯著的稀釋效應，待測物在萃取溶劑中的最終濃度將會嚴重降低，從而降低信號強度；噴霧溶劑量過少會導致過快揮發，影響萃取時間，且揮發過快也會導致噴霧信號的不連續。實驗考察了分析4 μL樣品時，乙酸乙酯用量(4、8、12、16 μL)對卡馬西平離子信號和噴霧時間的影響。結果顯示，使用8 μL乙酸乙酯時，分析物信號最強；而乙酸乙酯用量大于8 μL時，噴霧持續時間相對較長。因此噴霧溶劑最佳用量選擇8 μL。

此外，還研究了萃取和噴霧溶劑的種類對質譜信號的影響。選取的溶劑同時作為萃取溶劑和噴霧溶劑，需綜合考慮待測物在其中的溶解度和離子化效率、溶劑揮發性等因素。通過實驗發現與樣品液滴和水凝膠均不互溶的多種溶劑能觀察到噴霧現象，質譜信號由強到弱依次為乙酸乙酯、叔丁基甲醚、正丁醇、丙酮、氯仿、正己烷和甲苯，因此選擇乙酸乙酯為最佳的萃取和噴霧溶劑。

2.4 定量分析

在最佳條件下，采用本方法對人尿液中阿米替林(AMT)進行定量分析。AMT以5、50、200、500、1 000 ng/mL的質量濃度加入尿液，阿米替林-D6(D6-AMT)以100 ng/mL的質量濃度作為同位素標記的內標物加入。將4 μL配制好的尿液滴加在水凝膠涂覆紙基質上，再滴加8 μL乙酸乙酯形成液液萃取，施加3 kV高壓進行檢測，每個濃度重復測定3次。以相對強度(AMT/D6-AMT，y)與對應人尿液中阿米替林質量濃度(x,ng/mL)繪制標準曲線，得其線性方程為y=0.006 7x+0.148 6，r2=0.999 4。以加入內標的空白樣品的3倍標準偏差(n=3)除以標準曲線的斜率計算得AMT的檢出限(LOD)為0.21 ng/mL。分別采用本方法和紙噴霧質譜方法對含有阿替洛爾、卡馬西平或磺胺二甲基嘧啶的兔全血進行定量分析，計算得到各化合物的LOD，結果見表1，本方法定量分析檢測靈敏度提升了7～33倍。

表1 使用水凝膠涂覆紙噴霧質譜分析4種藥物的檢出限及與紙噴霧質譜的對比

2.5 水凝膠涂覆紙噴霧質譜對生物流體中藥物的直接分析

水凝膠涂覆紙噴霧質譜可實現對復雜生物流體中藥物的直接分析。未進行任何前處理，使用水凝膠涂覆紙噴霧質譜在兔全血和人尿樣中直接檢測卡馬西平的結果，及其與紙噴霧質譜檢測結果的對比見圖2。全質譜圖中m/z237為卡馬西平的質子加合峰，MS/MS譜圖中m/z194為卡馬西平的特征子離子峰。

圖2 水凝膠涂覆和常規紙噴霧質譜在生物流體中直接分析卡馬西平的譜圖

3 結 論

本研究利用水凝膠限制溶液擴散的性質，開發了一種水凝膠涂覆紙噴霧離子化技術，可以有效結合液液萃取技術，實現生物流體樣品的高靈敏定量分析。本方法制備快速、簡單可靠，能直接分析生物流體中的藥物，且能延長穩定噴霧時間，提升質譜信號強度。通過加入內標，實現了對全血和尿液中藥物的直接定量分析，檢出限比常規紙噴霧離子化降低7～33倍，在臨床實時檢測中具有較大潛力。