黃芩-梔子配伍治療糖尿病腎病大鼠的尿液代謝組學研究

程曉旭,門麗慧,皮子鳳,宋鳳瑞,劉志強

(1.中國科學院長春應(yīng)用化學研究所 長春質(zhì)譜中心 吉林省中藥化學與質(zhì)譜重點實驗室，吉林 長春 130022；2.中國科學技術(shù)大學 應(yīng)用化學與工程學院，安徽 合肥 230026；3.吉林大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，吉林 長春 130021)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是指糖尿病微血管病變導致的腎小球硬化，又稱糖尿病腎小球硬化癥[1-2]，是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，極易發(fā)展為終末期腎病[3]。根據(jù)流行病學統(tǒng)計研究，預計到2030年，世界范圍內(nèi)的糖尿病患者將達到3.66億，而糖尿病腎病患者將超過1億。糖尿病腎病發(fā)病機制復雜，涉及因素眾多。許多研究表明，中藥可以通過多途徑、多靶點治療糖尿病并發(fā)癥，其中，中藥黃芩和梔子對糖尿病腎病的治療作用日漸受到關(guān)注。

黃芩(RadixScutellariae)為唇形科植物黃芩(ScutellariabailensisGeorgi)的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血等作用[4]。黃酮類化合物為黃芩的主要活性成分，其中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素是黃芩的特征性成分。研究表明黃芩及其黃酮類活性成分具有降糖、抗氧化、調(diào)節(jié)細胞因子和調(diào)節(jié)糖尿病腎病引起的血流動力學改變等作用，可以多途徑、多靶點延緩糖尿病腎病的發(fā)展過程[5-6]。

梔子(Gardeniajasminoides)是茜草科梔子屬植物，中藥梔子是其干燥成熟果實，具有涼血解毒、清熱利尿的功效[7]。研究發(fā)現(xiàn)，梔子的主要成分為環(huán)烯醚萜類化合物，包括梔子苷、山梔苷、京尼平苷等[8]。大量體內(nèi)外實驗表明梔子具有抗炎、抗氧化、降血壓等生物活性，對糖尿病及其并發(fā)癥的治療效果顯著[9]。

據(jù)歷代本草及醫(yī)學文獻記載，黃芩-梔子藥對為古方常用藥對，配伍應(yīng)用于許多傳統(tǒng)經(jīng)方。劉舟[10]收集了《中華醫(yī)方精選辭典》和《中藥大辭典》中有關(guān)黃芩的論述和方劑,共收集到含黃芩的成方1 067個，涉及中藥272味，除黃連外，梔子與黃芩的配伍頻次位居第二，在228首方劑配伍中出現(xiàn),被廣泛應(yīng)用于治療肺系病、腎系病、心系病、肝膽系疾病和脾胃系疾病。《中國藥典》[11](2015年版一部)收載了52首含黃芩梔子配伍的方劑，如梔芩清熱合劑、八正合劑、分清五淋丸、龍膽泄肝湯、導赤丸、黃連解毒湯等。黃芩、梔子飲片配伍有其深厚的中醫(yī)藥理論基礎(chǔ)，是中醫(yī)臨床相須炮制配伍的典型范例。

糖尿病腎病早期并沒有明顯的臨床癥狀，但是許多內(nèi)源性代謝物在臨床癥狀出現(xiàn)以前已經(jīng)發(fā)生了改變。代謝組學可以對內(nèi)源性代謝物進行全面分析，被廣泛應(yīng)用于疾病發(fā)生機制的研究[12]。Solini等[13]利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對286例Ⅱ型糖尿病患者的血清樣本和尿液樣本進行了分析，鑒定出5種能夠早期預測腎功能損傷進展情況的代謝物。Hirayama等[14]利用毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用的方法對78例糖尿病患者的血清樣品進行了分析，鑒定出用來區(qū)分糖尿病腎病不同進展階段的19個代謝物。將代謝組學技術(shù)應(yīng)用于糖尿病及其并發(fā)癥的研究中，對糖尿病腎病的早期診斷和早期治療具有重要意義。因此，本文采用代謝組學方法，基于UHPLC-Q-TOF MS技術(shù)，對黃芩-梔子藥對對糖尿病腎病大鼠治療前后尿液中的內(nèi)源性代謝物進行全面地分析鑒定，將藥對治療組與前期工作中黃芩治療組(HQ group)和梔子治療組(ZZ group)的治療效果進行了比較，從整體角度闡述該藥對的配伍科學性及其作用機制。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Waters ACQUITY UHPLC system，配有BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1 mm×50 m)；Waters Q-TOF SYNAPT G2 HDMS質(zhì)譜儀，配有4.1版本的MarkerLynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和EZinfo 2.0統(tǒng)計軟件。

1.2 試 劑

中藥黃芩、梔子(北京同仁堂長春藥店，由長春中醫(yī)藥大學王淑敏教授鑒定)；鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲酸(色譜純)購自Fisher Scientific公司；去離子水經(jīng)Milli-Q plus制得；血糖儀、血糖試紙購自北京怡成生物電子技術(shù)有限公司。

SD 大鼠購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證行SCXK(遼)2015-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 動物實驗

正常對照組(Control group，C組)：8只SD雄性大鼠，標準飼料正常喂養(yǎng)。

Ⅱ型糖尿病大鼠造模參照文獻[15]進行，利用高脂高糖飼料喂養(yǎng)并腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)成功建立糖尿糖大鼠模型。16只糖尿病大鼠隨機分為模型組(Model group，M組)和黃芩-梔子藥對組(HZYD group)，組間血糖差異≤1 mmol/L。

將黃岑-梔子提取物粉末使用超純水溶解，黃岑-梔子藥對組按3 g生藥/kg的劑量每日灌胃給藥1次，模型組和正常對照組分別灌胃與黃岑-梔子藥對組同等體積的蒸餾水，連續(xù)灌胃12周。

2.2 樣品收集與制備

按2∶1的質(zhì)量比準確稱取中藥黃芩和梔子藥材粗粉，以8倍量60%乙醇加熱回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液并旋蒸至近干后凍干，得到黃芩-梔子提取物粉末，使用時按給藥量溶解。

收集給藥12周后的大鼠尿液，記錄大鼠24 h排尿量，樣品分裝，-80 ℃冰箱保存待測。使用前4 ℃融化尿液樣品，取1 mL于1.5 mL離心管中，在4 ℃下10 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm水相濾膜過濾，供UHPLC-Q-TOF MS測定。

2.3 色譜-質(zhì)譜條件及樣品分析

2.3.1 色譜條件流動相A：0.1%甲酸水,流動相B：乙腈；梯度洗脫：0～3 min,5%～20% B；3～6 min,20%～40% B；6～8 min,40%～100% B；8～10 min,100% B；10～10.1 min,100%～5% B；10.1～14 min,5% B；流速：0.4 mL/min，柱溫35 ℃，樣品室溫度4 ℃，進樣量5.0 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源正負離子檢測模式，電離源溫度為120 ℃，去溶劑氣溫度為350 ℃，錐孔氣和去溶劑氣均為氮氣，流速分別為50 L/h和700 L/h。正離子模式下毛細管電壓為3.0 kV，錐孔電壓為30 V，提取錐孔電壓為5.0 V；負離子模式下毛細管電壓為2.5 kV，錐孔電壓為30 V，提取錐孔電壓為5.0 V。掃描范圍為100～1 000m/z，掃描時間為0.2 s。以甲酸鈉建立質(zhì)量軸標準曲線，亮氨酸腦啡肽(Leucine-enkephalin，LE)進行實時質(zhì)量校正以確保質(zhì)量精度和重現(xiàn)性。

為得到相對全面和整體的代謝物輪廓，保證分析系統(tǒng)的可靠性及穩(wěn)定性，在整個分析過程中，重復運行質(zhì)控樣品(Quality control，QC)來衡量UPLC-MS分析方法的穩(wěn)定性。從正常樣品中各取30 μL混合，制得QC樣品，在用于方法驗證時，為避免誤差，QC樣品將被隨機測試。樣品分析前，先運行6次QC樣品以平衡系統(tǒng)，樣品檢測過程中，每檢測10個正常樣品后運行1次 QC 樣品以衡量系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用MassLynx V 4.1(Waters)軟件對MassLynx V4.1 UHPLC-MS的原始數(shù)據(jù)進行峰檢測，MarkerLynx Application Manager(Waters)將自動進行離子對提取、峰對齊、峰匹配和峰強度校正,得到的數(shù)據(jù)矩陣通過Umetrics Ezinfo 2.0(Waters Corporation，Milford，USA)進行多變量分析。利用生物學數(shù)據(jù)庫，如HMDB(http://www.hmdb.ca/)、METLIN(http://metlin.scripps.edu/)、Massbank(http://www.massbank.jp/)和KEGG(https://www.kegg.jp/)等進行生物標記物的鑒定和代謝通路的分析。

2.5 生物標記物的鑒定

采用基于UHPLC-Q-TOP MS的代謝組學方法分析C組大鼠和M組大鼠尿液中內(nèi)源性代謝物的變化，結(jié)合主成分分析(Principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)進行數(shù)據(jù)分析，篩選潛在生物標記物。由PCA得分圖(圖1)可知，正離子和負離子模式下M組與C組大鼠的尿液代謝輪廓區(qū)分明顯，DN大鼠尿液代謝出現(xiàn)明顯的擾動。S-plot圖(圖2)中每一個點都代表一個化合物，距離原點越遠的點，其代表的化合物對分組的影響越大，VIP值越高。選擇VIP值大于1且獨立T檢驗的p值小于0.05 的化合物為潛在生物標記物,根據(jù)它們的精確分子量和串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果與 Human Metabolome Database(HMDB)和 Mass Bank等質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫質(zhì)譜信息的匹配，對可能的潛在標記物進行鑒定。綜合以上信息，共鑒定出與糖尿病腎病相關(guān)的潛在生物標記物31個，對比黃岑-梔子藥對組與模型組中各標記物的含量，得到藥對回調(diào)的生物標記物16個，結(jié)果列于表1及表2。

圖2 M組和C組大鼠12周尿液樣品經(jīng)OPLS-DA分析獲得的S-plot圖

表1 正離子模式下DN大鼠尿液生物標記物和變化趨勢

(續(xù)表1)

PotentialbiomarkersRt(min)Measuredmass(Da)Error(ppm)MolecularChangetrendM/CHZYD/MHQ/M[16]ZZ/M[17]3-Indolecarboxylicacidglucuronide(3-吲哚羧酸葡糖苷酸)1.89338.08681.0C15H15NO8↑×↓×Glucose(葡萄糖)1.21181.06918.6C6H12O6↑×↓×4,6-Dihydroxyquinoline(4,6-二羥基喹啉)3.62162.05659.5C9H7NO2↓×↑×Histidinal(組氨醛)0.68140.08068.8C6H9N3O↑×↓×Imidazoleaceticacid(咪唑乙酸)0.61127.04937.1C5H6N2O2↑×↓×Phenylaceticacid(苯乙酸)2.60137.05813.6C8H8O2↑×↓×Ornithine(鳥氨酸)4.81133.09967.9C5H12N2O2↑×↓×Leucine(亮氨酸)2.30132.10097.6C6H13NO2↑×↓×Pantetheine(泛酰硫氫乙胺)2.47279.13812.9C11H22N2O4S↑×↓×Xanthosine(黃嘌呤核苷)3.12285.08102.7C10H12N4O6↑×↓×5-Hydroxykynurenamine(5-羥基犬尿胺二鹽酸鹽)2.97181.09596.9C9H12N2O2↓×-×Phenylacetaldehyde(苯乙醛)3.00121.06689.2C8H8O↑×-×Hydrocinnamicacid(氫化肉桂酸)7.57151.07533.6C9H10O2↑--×L-Cysteine(L-半胱氨酸)3.20122.02808.0C3H7NO2S↓×-×Kynurenicacid(犬尿喹啉酸)2.17190.05000.7C10H7NO3↑××↓Creatinine(肌酐)0.86114.06652.7C4H7N3O↑××↓6-Hydroxy-5-methoxyindoleglucuronide(6-羥基-5-甲氧基吲哚葡糖苷酸)2.38340.10377.1C15H17NO8↑××-6-Methoxy-pyridine-3-carboxylicacid(6-甲氧基-吡啶-3-羧酸)0.61154.05075.4C7H7NO3↓××↑3-Methoxybenzenepropanoicacid(3-甲氧基苯丙酸)3.52181.08674.3C10H12O3↓××↑Indole-5,6-quinone(吲哚-5,6-苯醌)2.27148.04006.7C8H5NO2↓××↑Thymine(胸腺嘧啶)1.02127.05063.1C5H6N2O2↓××-Homocysteinethiolactone(同型半胱氨酸硫代內(nèi)酯)5.46118.03318.4C4H7NOS↓××↑

M/C：metabolite change trend in M group compared with C group;HZYD/M：metabolite change trend in HZYD group compared with M group;HQ/M：metabolite change trend in HQ group compared with M group;ZZ/M：metabolite change trend in ZZ group compared with M group;the up “↑” and down “↓”arrows represent the relative increasing or decreasing trend of the metabolites,“-”represents no significant differences between the two groups,“×”denotes the metabolite were not identified as potential biomarkers(M/C：模型組vs空白組；HZYD/M：黃芩-梔子藥對組vs模型組；HQ/M:黃芩組vs模型組；ZZ/M：梔子組vs模型組；“↑”表示含量上升，“↓”表示含量下降，“-”表示兩組相比較時，該化合物含量沒有顯著性差異；“×”表示該化合物未被鑒定為潛在生物標記物)

表2 負離子模式下DN大鼠尿液生物標記物和變化趨勢

(續(xù)表2)

PotentialbiomarkersRt(min)Measuredmass(Da)Error(ppm)MolecularChangetrend?M/CHZYD/MHQ/M[16]ZZ/M[17]Phenylacetylglutamine(苯乙酰谷氨酰胺)3.54263.10264.3C13H16N2O4↑×↓×Phenylpyruvicacid(苯丙酮酸)1.82163.04215.7C9H8O3↑×↓×3,4-Dihydroxymandelaldehyde(3,4-二羥基甘露醛)1.20167.03743.7C8H8O4↑×↓×Cholicacid(膽酸)9.01407.27991.7C24H40O5↑××↓3-Oxooctanoicacid(3-酮基辛酸)4.69157.08672.0C8H14O3↓××↑

*the same as those in table 1

2.6 生物標記物代謝通路分析

為闡明這些潛在生物標記物與糖尿病腎病的關(guān)系以及潛在生物標記物之間的相互聯(lián)系，在KEGG中檢索已獲得的潛在生物標記物，將得到的信息聯(lián)系起來，建立了黃芩-梔子藥對治療糖尿病腎病代謝網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖3。

圖3 黃芩-梔子藥對治療糖尿病腎病代謝網(wǎng)絡(luò)圖

由代謝網(wǎng)絡(luò)圖可知，黃芩-梔子藥對可能會通過調(diào)節(jié)糖尿病腎病引起的膽汁酸合成、能量代謝、苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝、色氨酸代謝等代謝通路的異常來阻斷病情的發(fā)展，發(fā)揮治療作用。

2.6.1 膽汁酸的生物合成通路膽汁酸是哺乳動物膽汁中發(fā)現(xiàn)的類固醇酸，是衍生自膽固醇分解代謝的兩親性甾體分子。脫氧膽酸是膽汁酸合成通路的重要組成部分，12-酮基去氧膽酸、3-氧代-4,6-膽甾烯酸和7-酮基脫氧膽酸是膽汁酸類內(nèi)源性代謝物。作為一種重要的內(nèi)分泌信號因子，膽汁酸可以對脂質(zhì)、葡萄糖和能量代謝穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生不同影響，與肥胖和糖尿病的發(fā)病相關(guān)[18]。研究表明，正常體重以及超重Ⅱ型糖尿病患者的血糖與尿液膽汁酸排泄量呈正相關(guān)，機體通過膽汁酸信號傳導的代償性增加來維持體內(nèi)葡萄糖平衡[19]。本研究中糖尿病腎病大鼠尿液中膽汁酸的含量急劇上升，與上述研究結(jié)果一致。黃芩-梔子藥對可以降低膽汁酸合成通路中脫氧膽酸的含量(表1)，調(diào)節(jié)上升的膽汁酸，顯著降低12-酮基去氧膽酸、3-氧代-4,6-膽甾烯酸、脫氧膽酸和7-酮基脫氧膽酸的含量，提示黃芩-梔子藥對可能通過減少膽汁酸的合成和調(diào)節(jié)膽汁酸代謝改善糖尿病腎病病程發(fā)展。本課題組前期分別考察了梔子、黃芩單味藥對糖尿病腎病大鼠尿液中內(nèi)源性代謝物的影響[16-17]，綜合表1和表2結(jié)果可知，黃芩對膽汁酸的合成與代謝并無影響，黃芩-梔子藥對對膽汁酸的調(diào)節(jié)作用可能主要來自于梔子。

2.6.2 能量代謝通路三羧酸循環(huán)是機體的主要供能途徑，琥珀酸和檸檬酸是其重要組成部分，二者的含量變化反應(yīng)了供能狀況的變化。三羧酸循環(huán)代謝向氧化磷酸戊糖途徑的通量相對增加，會導致琥珀酸產(chǎn)生增加，減少通路中副產(chǎn)物的形成，破壞氧化還原平衡[20-21]。琥珀酸和檸檬酸不僅與能量代謝相關(guān)，還是腎臟損傷的標記物。本研究中，模型組大鼠尿液中琥珀酸含量升高，檸檬酸含量降低，可能是三羧酸循環(huán)和腎臟功能損傷共同作用的結(jié)果。梔子有加重檸檬酸含量下降的作用，黃芩有回調(diào)檸檬酸含量的作用，配伍之后，綜合二者藥效，黃芩-梔子藥對仍起到了回調(diào)檸檬酸含量的作用。此外，由表2可以看出，黃芩和梔子單味藥并未對琥珀酸含量的升高有任何調(diào)節(jié)作用，但黃芩-梔子藥對卻對琥珀酸起到了回調(diào)作用，這說明黃芩與梔子之間，黃芩、梔子與藥對之間的作用都不盡相同，黃芩和梔子的配伍使藥對發(fā)揮了單味藥沒有的功效。

2.6.3 苯丙氨酸、酪氨酸與色氨酸代謝通路慢性腎衰竭與苯丙氨酸和酪氨酸的合成、代謝以及尿液排泄量的變化密切相關(guān)[22-23]。苯丙氨酸是酪氨酸的前體化合物，腎臟功能受到損害時，苯丙氨酸向酪氨酸轉(zhuǎn)化受阻，受阻程度與腎臟受損程度相關(guān)。苯丙氨酸是一種必需氨基酸，主要代謝途徑為羥基化生成酪氨酸。苯丙氨酸還可以轉(zhuǎn)化為苯丙酮酸，苯丙酮酸還原后生成苯基乳酸，或氧化脫羧生成苯乙酸，但這種途徑作用較弱[24]。綜合表1和表2可知，糖尿病大鼠尿液中苯丙酮酸、苯乳酸、苯乙酸和苯乙酰谷氨酰胺含量均升高，可能意味著苯丙氨酸向酪氨酸轉(zhuǎn)化受阻，從而導致苯丙氨酸更多的向苯丙酮酸代謝途徑代謝。黃芩可以下調(diào)苯丙酮酸、苯乳酸和苯乙酸的含量，但梔子和藥對均無下調(diào)作用，說明對苯丙氨酸代謝通路的調(diào)節(jié)作用主要來自于黃芩。

腎臟是消除色氨酸及其代謝物的主要器官。95%左右的色氨酸在腎臟經(jīng)犬尿氨酸途徑代謝，最終產(chǎn)生犬尿喹啉酸等代謝物[25-26]。犬尿喹啉酸與腎小球濾過率呈負相關(guān)，色氨酸代謝異常與Ⅱ型糖尿病的發(fā)病息息相關(guān)[27]。與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠尿液中犬尿喹啉酸含量升高，表明腎臟功能受到損害。梔子可以降低犬尿喹啉酸的含量，對腎臟起到一定的保護作用。黃芩和藥對都未對犬尿喹啉酸起到調(diào)節(jié)作用，可能是藥對配伍后，來自梔子的部分藥效降低了。

2.6.4 尿毒素代謝通路除圖3所示的各種代謝通路外，尿毒素代謝也是黃芩-梔子藥對治療糖尿病腎病的重要代謝通路。硫酸對甲酚是對甲苯酚通過尿液排泄的衍生物，是一種典型的尿毒素。腸道厭氧菌將食物中的苯丙氨酸和酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥基苯乙酸，脫羧后轉(zhuǎn)變?yōu)閷追樱瑢追釉谀c道上皮細胞的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榱蛩釋追覽28]。硫酸對甲酚是腎病中常見的蛋白結(jié)合分子，作為一種尿毒素，具有高蛋白結(jié)合率、低排泄率和促氧化應(yīng)激作用，較難通過透析排出體外[29]。硫酸對甲酚的排泄量與腎小球濾過功能密切相關(guān)，糖尿病腎病導致腎臟功能受損時，體內(nèi)硫酸對甲酚含量升高[30]，促使炎癥發(fā)生，硫酸對甲酚在血液中與白蛋白的結(jié)合增多，可以加速腎病發(fā)展，對全身多個組織和器官造成毒性損害，是腎臟疾病惡化的重要指示代謝物。糖尿病腎病大鼠尿液中的硫酸對甲酚含量明顯升高，經(jīng)黃芩、梔子單味藥治療后，含量并未發(fā)生變化，但經(jīng)黃芩-梔子藥對治療干預后，其含量顯著降低,說明黃芩-梔子藥對可能通過對腸道菌群的調(diào)節(jié)，減少硫酸對甲酚的產(chǎn)生，或通過增強腎小球濾過功能使硫酸對甲酚排泄量增多?？珊侠硗茰y經(jīng)黃芩-梔子藥對治療后，受損的腎臟功能得到了改善。

3 結(jié) 論

本研究采用 UPLC-Q-TOF MS 結(jié)合 OPLS-DA 的分析手段，進行了黃芩-梔子藥對治療糖尿病腎病大鼠的尿液代謝組學研究，對糖尿病腎病大鼠尿液中的內(nèi)源性代謝物和代謝通路進行了全面地分析。黃芩-梔子藥對可以回調(diào)16種糖尿病腎病相關(guān)的生物標記物，主要通過調(diào)節(jié)膽汁酸的合成與代謝、能量代謝和尿毒素代謝改善糖尿病腎病引起的尿液代謝輪廓變化。從黃芩-梔子藥對整體作用角度初步闡明了其治療糖尿病腎病的作用機理，證明了黃芩-梔子藥對配伍后，可以產(chǎn)生單味藥沒有的藥效。