福爾馬林固定石蠟包埋組織切片蛋白質組分析方法與應用研究進展

翁 爽,王明超，應萬濤,錢小紅

(中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院生命組學研究所，北京 102206)

臨床蛋白質組學研究是通過發現不同病患和健康人之間的蛋白質及其修飾水平的表達豐度差異，以實現疾病人群的分子分型，發現潛在的藥物干預靶標和診斷標志物。除體液外，常用的臨床樣本基本來自活檢、手術切除等獲得的組織。組織樣本主要分為兩種：新鮮/凍存和福爾馬林固定石蠟包埋(Formalin-fixed and paraffin-embedding，FFPE)組織樣本[1]，其中FFPE組織在常溫下可穩定儲存數十年，是組織病理學分析的金標準[2-3]。經過一個世紀的發展，在全世界范圍內已經累積了大量的FFPE組織樣本。FFPE組織樣本的一個重要優勢是具備長期的臨床隨訪信息，包括個體生活史、疾病分期、無病生存期和死亡時間等信息。這些信息對于多組學分析和目標導向的精準醫學實踐異常重要，而這往往是新鮮凍存組織難以達到的。基于患者人群的FFPE組織開展差異蛋白質組學研究，可以充分利用罕見疾病或腫瘤等樣本，發現與疾病診斷、分型、預后及治療密切相關的靶蛋白。從技術角度，FFPE組織由于經過甲醛固定、脫水和封蠟等處理，且通常只能獲得幾個微米厚度的切片，因此針對微量切片的FFPE組織蛋白質提取和消化、質譜分析等過程，本身又構成了極大的挑戰。本綜述將首先概述針對FFPE組織切片蛋白質組分析的技術發展，隨后概括各種疾病尤其是腫瘤中差異蛋白和候選標志物的發現研究。

1 FFPE組織切片樣本的制備方法

福爾馬林固定方法使組織結構和細胞形態得到穩定的保護，且與蘇木精和曙紅染色程序相容，因此成為病理組織保存的金標準[3]。其基本流程為：手術獲得的組織清洗后立即用10%福爾馬林溶液(即40 g/L甲醛水溶液)固定24～48 h；取出后切成適當厚度塊狀(通常為3 mm)，使用不同濃度乙醇水溶液和二甲苯脫水后，包埋在熔融的石蠟中并使其在室溫下固化，形成FFPE組織[1]。在組織病理學的研究中，常將FFPE組織切成3～10 μm的薄片并貼于載玻片上，用于后續分析。臨床樣本取材過程中的質控和樣本固定流程的標準化，是影響FFPE組織切片蛋白質表達譜穩定性的兩個重要因素。因此在取材時將樣本進行清洗以降低來自血液的污染，以及縮短手術后組織常溫放置時間，是FFPE組織樣本制備以及后續分析的關鍵。

2 FFPE組織切片樣本制備過程中的化學修飾

圖1 蛋白質甲醛交聯的反應機理[4]

上述化學修飾，在不同水平影響著蛋白質的結構，主要表現為：在一級結構上對單個氨基酸產生影響，使氨基酸修飾發生改變或增加額外修飾；在二級結構上對肽鏈的ɑ螺旋和β折疊以及不同片層產生修飾，或產生片層之間的交聯；在三級結構上引起蛋白質高級結構的改變(3D修飾)；在四級結構上通過交聯聚合產生多種蛋白質的交聯復合物。這些影響使肽段的理化性質發生改變，高級結構的交聯更會增加蛋白提取以及酶切的難度[5]。因而，選擇提取FFPE組織切片時的溶劑顯得尤其重要。

3 FFPE組織切片樣本蛋白的提取

FFPE組織來源的切片可直接進行蛋白質提取[6]，但主要挑戰之一是建立標準化高效的提取方案，從而實現微量FFPE組織中蛋白質的提取。FFPE組織切片在蛋白提取前需要進行脫蠟和重水化。常用脫蠟液為二甲苯，為了避免二甲苯的毒性，近年來有研究使用90～95 ℃的熱水替代二甲苯和乙醇進行脫蠟和重水化[7]。但該新方法目前尚未完全標準化，二甲苯脫蠟和乙醇重水化仍然是FFPE組織切片進行蛋白提取的標準操作。

FFPE組織切片樣本裂解和蛋白提取時，裂解液的成分以及樣本解交聯是關鍵。商業化的裂解液較多使用酸不穩定表面活性劑RapiGest(Waters)[8-10]，以及商業試劑盒，如Liquid Tissue MS protein Prep kit[11-13]、Qproteome FFPE tissue kit[14]等。商業化裂解液和試劑盒對蛋白提取的重現性較高，但其具體成分并不知曉，這將影響后續分析方法的建立。自制裂解液的種類較多，中性或堿性pH可提高組織蛋白的產率，此外更高的pH在理論上更能促進亞甲基橋的斷裂，因此常選用pH值4～9的Tris-HCl和十二烷基磺酸鈉(SDS)緩沖液進行組織樣本蛋白的提取[15-16]。Fowler等[17]通過大量比對，證明了SDS對FFPE組織蛋白提取的有效性。Broeckx等[18]對比了8種不同蛋白裂解液的提取效率，闡明了在提取液中加入2% SDS后，蛋白的回收率提高了15倍。目前，SDS已成功應用于結直腸癌、肺腺癌等疾病FFPE組織樣本的蛋白提取，以及后續的質譜分析[15，19]。但需要注意的是，過高濃度的SDS可能會影響蛋白的溶解以及酶切和分離效率，這種干擾效應可通過后續的肽段消化過程消減[15-16，20]。

盡管諸多裂解液之間存在差異，但普遍使用加熱解交聯提高蛋白提取的效率。這種技術基于Shi等[21]1991年創建的“熱誘導抗原修復”(Heat-induced antigen retrieval，HIAR)方法，其基本過程是將FFPE組織切片樣本用合適的裂解液溶解后，在90～120 ℃下加熱10 min至數小時。HIAR水解亞甲基橋，從而切斷蛋白之間的交聯。通常情況下，溫度越高達到相同質量的解交聯所需的時間越少，但目前尚無達到100%解交聯的實驗方案[22]。

4 FFPE組織切片蛋白質的消化

利用蛋白酶消化蛋白質提取物，進而產生肽段是蛋白質組樣本制備中必不可少的步驟。由于質譜儀與裂解液中部分試劑的不相容性，對于FFPE組織切片樣本，早期常用的消化方法是膠內酶切和溶液酶切。這兩種方法的主要優點是與裂解液中的去垢劑(尤其是SDS)相容，可在質譜上樣前將SDS等去垢劑去除[18，23-24]。但膠內酶切的缺點是肽的回收率較低[16]，溶液酶切則需對樣本進行脫鹽以減小對質譜的影響，而這些對微量樣本都是異常嚴峻的問題。

Wisniewski等[25]于2009年描述了一種稱為過濾器輔助樣品制備(Filter aided sample preparation，FASP)的酶切技術，該方法使用膜過濾器進行裂解液中SDS/尿素的替換。此后，Wisniewski等[16]于2011年進一步比較了用FASP和膠內酶切來處理微量的全細胞裂解液，結果表明FASP獲得的肽段產率高于50%，而膠內酶切平均低于20%；當樣本量低于10 μg時向裂解液中加入聚乙二醇20000(PEG20000),使肽段回收率提高了30%。Tanca等[20]于2014年對肝臟FFPE組織樣本進行了溶液酶切、FASP酶切、直接組織酶切(DT)的比較，發現FASP酶切得到的鑒定量最高(3種方法分別鑒定到1 616、2 076、1 940種蛋白)。近年出現了一種提取FFPE組織切片中的蛋白質并進行后續酶切的新方法：對單片FFPE組織切片進行裂解，在高溫加熱和超聲裂解后，調節pH至7～8，直接酶切(Direct trypsinization，DTR)[8-10]。該方法的蛋白鑒定量與FASP相當，且具有與各種經典組織學染色使用的染料兼容和酶切前的處理步驟較少的優點，比FASP更適合大規模樣本的處理；但其酶消化的漏切率較高，提取的蛋白偏性較大，非胰蛋白酶消化肽也較多[8，20]。Taverna等[26]于2019年提出了一種最新的酶切方法，即直接將微型化的聚合物凝膠置于FFPE組織切片區域上進行局部消化，該方法能夠區分組織區域，檢出區域間的差異表達蛋白。

綜上所述，目前最常用的FFPE組織切片消化方法是加入胰蛋白酶進行FASP酶切，新型的酶切方法和蛋白酶聯用技術也在逐步發展。胰蛋白酶仍是最常使用的蛋白酶[27]，其對FFPE組織切片樣本的蛋白鑒定最有利，將其與其它種類酶進行聯用，可在一定程度上提高蛋白的鑒定量[15，28]。而FASP酶切具備較好的兼容性，在保證肽段產率以及低漏切率的同時，可以獲得最高的鑒定量[8，16,20]。

5 激光捕獲顯微切割技術

激光捕獲顯微切割(Laser capture microdissection，LCM)技術是在保存要捕獲的細胞和其周圍組織形態完整的前提下，直接從組織切片中獲取目標細胞。LCM與染色搭配，可以選擇性獲取組織塊中特定區域[29]。FFPE組織的完整結構與LCM相結合，可實現局部區域的精確和可重復的空間分離，在一定程度上可以消除腫瘤樣本的異質性[30]。通過LCM收集FFPE組織切片樣本，以獲得純度較高的細胞或細胞外基質組分，開展更為精準的蛋白質組分析，已經成為一種發展趨勢。Wood[31]于2017年利用LCM從快速進展性阿爾茨海默癥(rpAD)和典型散發性AD(sAD) FFPE腦組織切片中分離淀粉樣斑塊，確定了兩種疾病之間差異表達的141種蛋白質。Alrawashdeh等[32]于2019年用LCM收集神經浸潤(PNI)和非神經浸潤的胰腺導管癌上皮細胞，發現了PNI表達改變的蛋白。Eckert等[33]通過LCM從卵巢癌FFPE組織切片中收集約5 000個基質細胞，平均每個樣本定量鑒定4 428種蛋白。

6 FFPE組織切片來源肽段生物質譜分析

FFPE切片樣本蛋白質組學的發展前期均以數據依賴性采集(DDA)模式進行質譜分析，上述研究皆是樣本預分離結合DDA方法進行質譜分析。DDA方法的蛋白鑒定靈敏度高，但其樣本檢測時有一定隨機性，會降低蛋白質組學的采樣深度[35-36]。樣本預分離結合DDA的方法雖可以增加蛋白質組覆蓋度，但也會增加時間和資源的浪費，以及樣本間的變異性。非數據依賴采集(DIA)模式則是將特定窗口內所有母離子進行碎裂，實現了樣本中肽段信號的全譜圖化記錄，包括各種可能的翻譯后修飾形式，從而實現了FFPE組織切片的數字化信息記錄[37]。Wojcik等[38]于2019年對惡性外周神經鞘膜瘤(MPNST)FFPE組織樣本和細胞系分別進行DDA和DIA數據采集，DDA數據無法可靠區分共洗脫物質，而細胞DIA數據中多梳復合物2(PRC2)與腫瘤中結果高度吻合，從而發現PRC2在發病機制中的作用。Azimi等[39]采用DIA分析正常皮膚和角質細胞病變(KSL)的FFPE樣品，從93個樣本中定量了3 574種蛋白質，并找到了可以區分疾病的差異表達蛋白。Kim等[13]則采用FFPE腫瘤活檢組織的全蛋白質譜，將兩種胃癌樣本從結直腸癌樣本中分離出來，并鑒定了特征蛋白(Signature proteins)。

DDA方法是目前FFPE組織切片樣本的主要數據采集方法，DIA方法的優勢在于其一針進樣檢測，即可實現蛋白質組的深度定量。由于方法本身的特性，DIA采集的數據覆蓋了更為全面的信息，對與疾病關聯的研究更加有利。因此，未來DIA方法可能會成為FFPE組織樣本蛋白質組學分析的主流技術。

7 FFPE樣本的翻譯后修飾研究

FFPE組織也可用于蛋白質翻譯后修飾的研究。Lai等[40]利用小鼠肝臟組織進行了FFPE樣本和新鮮/凍存樣本的比較，結果顯示兩種樣本中的磷酸化翻譯后修飾相似。Hinneburg等[41]從少量的FFPE樣本中釋放出N-和O-聚糖，并用于質譜分析，可得到單個聚糖的詳細信息。Wang等[19]從肺腺癌患者的FFPE組織切片中鑒定出58種N-聚糖成分，與正常人進行對比，鑒定出肺腺癌患者中差異表達的糖修飾(即高甘露糖型N-聚糖上調，唾液酸化的N-聚糖下調)。Holfeld等[42]從FFPE和最佳溫度冷凍切割的膀胱癌樣本中各鑒定出250和400個磷酸化位點，表明長期儲存臨床樣品仍可用于磷酸化修飾的檢測。上述研究表明，FFPE組織樣本處理過程并不影響蛋白質翻譯后修飾的研究。

8 基于FFPE樣本的生物標志物發現研究

臨床FFPE組織樣本庫中包括了大量罕見和常見疾病(如惡性腫瘤患者的組織樣本)，是蛋白質生物標志物發現和驗證的寶貴資源[43]。通過比較不同疾病組織與正常組織，可識別潛在的生物標志物。FFPE組織樣本處理技術及質譜策略目前已用于許多組織器官的疾病研究以及潛在疾病生物標志物的尋找。表1列舉了部分從2016年起通過FFPE組織樣本在腫瘤中尋找潛在生物標志物和藥靶的應用，包括甲狀腺癌[44]、小細胞肺癌[12]、卵巢癌[6，33]、結直腸癌[45-46]、腎透明細胞癌[47]、膀胱尿路上皮癌[48-49]、實體瘤[50]等疾病。

表1 腫瘤FFPE組織樣本研究中發現的潛在生物標志物(部分)

9 總結與展望

FFPE組織切片樣本的標準化制備、高存儲量、豐富的臨床回顧性信息等優勢，使其成為疾病生物標志物發現的豐富資源。在過去數十年中，FFPE組織切片蛋白質組學分析方法獲得了系列的發展，隨著裂解液的優化以及蛋白提取方法的發展，在樣本解交聯的同時可以達到更高效的蛋白提取。同時，在保證質譜兼容性的基礎上，實現了高效的樣本消化。方法的發展推進了FFPE蛋白質組學逐步應用于腫瘤等重大疾病的研究，并發現了系列候選標志分子(表1)。隨著蛋白質組學技術在速度、靈敏度、通量化水平的更高更快發展，基于FFPE組織切片的精準蛋白質組學應用還將繼續深入發展。同時，對已經發現的候選標志物，利用豐富的FFPE樣本庫，開展大規模的驗證工作，也將是未來一段時間FFPE組織樣本應用的一個重要內容，并將有利于推進更為精準、高效、實用的生物標志物靶標的發現。