MALDI質(zhì)譜技術(shù)在酶活性分析中的應(yīng)用

林 夕，玲 玲,國(guó)新華

(吉林大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012)

酶分子產(chǎn)生于活細(xì)胞，其是具有特異識(shí)別底物和催化功能性質(zhì)的蛋白質(zhì)或RNA分子，亦是一種極其重要的生物催化劑。人體和哺乳動(dòng)物體內(nèi)至少含有5 000種酶，在凝血過程、蛋白質(zhì)代謝、組織再生和免疫防御等許多生物活動(dòng)中扮演著重要角色[1-4]。酶活性的改變與糖尿病[5]、阿爾茲海默癥[6]、癌癥[7]、艾滋病[8]等許多疾病密切相關(guān)。酶活性抑制劑可以調(diào)控生物過程，用于疾病的治療，例如：人類免疫缺陷病毒(HIV)患者接受HIV-1蛋白酶抑制劑治療，可以抑制疾病的發(fā)展，延長(zhǎng)壽命。因此，發(fā)展高靈敏、高效的酶活性檢測(cè)技術(shù)和方法，同時(shí)有效篩選酶活性抑制劑對(duì)于疾病的診斷和治療具有重要意義。

傳統(tǒng)的免疫分析法是通過檢測(cè)酶的濃度間接確定酶活性。由于酶的濃度并不能直接代表酶的活性，因此常出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果[9-10]。針對(duì)底物設(shè)計(jì)的熒光探針，制備過程相對(duì)復(fù)雜，且光學(xué)信號(hào)易重疊，不適合多種酶的同時(shí)檢測(cè)[11-12]。質(zhì)譜法是通過檢測(cè)酶的底物和產(chǎn)物在酶作用下的信號(hào)變化來(lái)監(jiān)測(cè)酶活性，方法準(zhǔn)確性更高，而且適合多種酶的同時(shí)檢測(cè)。近年來(lái)，利用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)技術(shù)將鑭系元素標(biāo)記在多種蛋白酶底物上，應(yīng)用于多種蛋白酶的測(cè)定，取得了滿意的結(jié)果[13-14]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS)結(jié)合多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)技術(shù)亦被用于定量描述酶活動(dòng),被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”方法[15-16]。與ICP-MS和LC-MS相比，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)具有樣品用量少、分析速度快、高耐鹽和高通量的優(yōu)勢(shì)，在分析過程中可以簡(jiǎn)化復(fù)雜樣品的分離、除鹽和標(biāo)記步驟。MALDI質(zhì)譜離子化和MALDI靶板的修飾及生物芯片技術(shù)相結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)微量樣品的在線分離和富集，以及高效的酶活性分析和藥物篩選。本文綜述了國(guó)內(nèi)外利用MALDI-TOF MS檢測(cè)酶活性和藥物篩選的方法。這些方法主要分為兩類：一種是基于非均相酶催化反應(yīng)，將酶的底物固定在固體表面上，此表面與溶液相中的酶進(jìn)行反應(yīng)，再用MALDI-TOF MS進(jìn)行檢測(cè)；另一種是基于均相酶催化反應(yīng),即底物和酶在溶液相中反應(yīng)，再用MALDI-TOF MS檢測(cè)底物和產(chǎn)物。兩種方法的原理示意圖如圖1所示。

圖1 酶活性分析方法示意圖

1 基于非均相酶催化反應(yīng)

1.1 通過共價(jià)作用固定底物

Su等[17]在金基底上通過Au-S作用自組裝單分子層(SAMs)，此生物芯片非常適用于MALDI-TOF MS，因此稱為SAMDI(Self-assembled monolayers for desorption ionization)技術(shù)。如圖2[18]所示，馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)可與半胱氨酸殘基反應(yīng)從而固定蛋白激酶底物多肽，而寡聚乙二醇的設(shè)計(jì)能有效地抑制單分子層與蛋白質(zhì)之間的非特異性作用，確保單分子層只通過固定的配體與蛋白質(zhì)進(jìn)行特異性相互作用。這種多肽芯片可用MALDI-TOF MS表征。蛋白激酶活性通過底物肽和產(chǎn)物肽的信號(hào)來(lái)監(jiān)測(cè)。不同蛋白激酶底物的氨基酸序列不同，因此在一個(gè)芯片上固定多種多肽底物，可同時(shí)分析多種蛋白激酶。此方法評(píng)價(jià)了激酶抑制劑濃度對(duì)于激酶催化作用的抑制效果。

圖2 單分子層合成與酶活性表征的方法[18]

除了分析蛋白激酶，Kuo等[19]還將該方法運(yùn)用于其他酶活性檢測(cè)。通過分析CHRF巨核細(xì)胞(Mk)細(xì)胞裂解液中賴氨酸脫乙酰酶(KDAC)的活性，驗(yàn)證了該方法的可行性。利用類特異性去乙酰化酶抑制劑研究表明，分化晚期的巨核細(xì)胞表現(xiàn)為6種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴型的去乙酰化酶(SIRTs)活性明顯下降，而另11種二價(jià)離子依賴型的去乙酰化酶(KDACs1-11)活性變化不大。該研究建立的平臺(tái)可用于識(shí)別細(xì)胞裂解物中多種酶活性的變化。

除了將肽段作為金-硫單分子層的固定化底物外，Ban等[20]還設(shè)計(jì)了直接在生物芯片上制備寡聚糖陣列的方法，以快速有效地研究其相關(guān)蛋白的生物活性。該方法首先將含有苯酚末端的硫醇烷基鏈組裝到金表面，酚基作為親核試劑與第一個(gè)糖結(jié)合，再利用糖的末端高效地合成不同的寡聚糖陣列，并檢測(cè)了β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的特異性，如圖3所示。此外，Kim等[21]通過將帶有生物素標(biāo)記的DNA底物固定在自組裝的單層鏈霉親和蛋白層上，制備了寡核苷酸陣列。該陣列在3’端具有正常匹配和錯(cuò)配堿基對(duì)的復(fù)合物，還包括該位點(diǎn)的一些刪除和插入。用連接酶和三磷酸腺苷(ATP)或三磷酸類似物核苷處理陣列，再用基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜分析，比較了5′-探針鏈的腺化和連接的產(chǎn)物量。由此揭示了連接酶特異性，并發(fā)現(xiàn)使用ATP類似物可以提高酶的特異性。該方法可廣泛應(yīng)用于以核酸為底物的酶活性分析。Choi等[22]報(bào)道了一種基于在金上自組裝單分子層的氯霉素(CAP)乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)活性的測(cè)定方法。在乙酰輔酶A存在下，CAT將單分子層上的CAP轉(zhuǎn)化為乙酰化的CAP。利用MALDI質(zhì)譜技術(shù)，通過觀察CAP分子質(zhì)量的變化，直接監(jiān)測(cè)其轉(zhuǎn)化過程。

圖3 在芯片上合成低聚糖的方法[20]

以上方法的特點(diǎn)在于將酶底物固定在惰性表面上，通過清洗去除干擾分子，很大程度上簡(jiǎn)化了樣品前處理過程。這種策略基于MALDI-TOF MS的特點(diǎn)提供了一種簡(jiǎn)單、快速、高通量、免標(biāo)記的檢測(cè)方法。然而，此方法通過共價(jià)鍵(Au-S)固定底物,用MALDI-TOF MS檢測(cè)時(shí)需經(jīng)過Au-S鍵斷裂過程。因此可能會(huì)導(dǎo)致底物和產(chǎn)物測(cè)定不完全,影響定量效果。Hu等[23]提出了一種肽編碼的酶活性分析微板。將蛋白酶特異性的底物肽段直接固定在微板上，與目標(biāo)蛋白酶作用后，從微板中釋放出編碼區(qū)域，以單氨基酸差異的相應(yīng)肽段為內(nèi)標(biāo)直接定量分析。編碼區(qū)域可作為唯一的“蛋白酶ID”用于識(shí)別相應(yīng)的蛋白酶，裂解產(chǎn)物的量用于蛋白酶活性分析。以胰酶和糜蛋白酶為模型蛋白酶進(jìn)行了多重蛋白酶試驗(yàn)，結(jié)果顯示肽編碼微板具有良好的選擇性。該方法為多種蛋白酶的鑒定和活性定量分析提供了有力的工具，但主要針對(duì)蛋白水解酶，不適用于蛋白激酶等其他酶。

1.2 通過非共價(jià)作用固定底物

除了在金-硫單分子層上利用含特殊官能團(tuán)的硫醇烷基鏈來(lái)固定特殊肽段或寡聚糖來(lái)制備陣列，酶底物的固定化過程還可通過非共價(jià)作用完成。Sanchez-Ruiz等[24]將疏水自組裝單層膜置于金板上作為支架，然后將一系列用脂質(zhì)修飾的不同寡糖通過疏水-疏水相互作用固定在疏水單分子層板上，形成寡聚糖陣列(如圖4)。基于酶作用后產(chǎn)物的不同，此陣列使區(qū)分不同的糖基水解酶活性成為可能，提高了聚糖陣列的結(jié)構(gòu)多樣性。隨后，Beloqui等[25]利用該方法快速檢測(cè)了環(huán)境樣品中糖基水解酶活性和特異性。與其他方法相比，基于膠體的系統(tǒng)需要優(yōu)化。此方法疏水表面和糖的標(biāo)記更易制備，而且平面非多孔表面使酶易于接近反應(yīng)表面和提高穩(wěn)定性。該方法適于環(huán)境樣品和復(fù)雜體液的功能分析。此外，該課題組[26]還對(duì)單分子層的材料進(jìn)行了改良，選擇商用的ITO涂層玻片，用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)對(duì)其硅烷化，然后與硬脂酸偶聯(lián)，為固定脂質(zhì)標(biāo)記的生物分子創(chuàng)造了疏水支撐層。這種單分子層基底可獲得更高的表面覆蓋度和疏水性。聚糖與疏水層結(jié)合能形成良好的斑點(diǎn)形態(tài)，為酶活性分析提供了良好的基礎(chǔ)。然而MALDI-TOF MS檢測(cè)技術(shù)對(duì)待測(cè)物的質(zhì)譜響應(yīng)性要求高，因此質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)直接影響定性、定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性。Hu等[27]用兩親性的磷脂標(biāo)記蛋白酶底物多肽，通過疏水相互作用固定在硬脂酸改性的ITO載玻片上，組裝成不同半胱天冬酶的肽底物陣列，通過對(duì)酶裂解前后的肽段進(jìn)行鑒定能夠直接分析多種酶活性。由于磷脂在負(fù)離子模式下的離子化效率高，可得到很好的質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)。因此，該方法用于質(zhì)譜成像獲得了良好的可視化結(jié)果，具有多重酶活性分析和可視化特點(diǎn)，為酶的活性分析、耐藥性鑒定和抗癌藥物療效評(píng)價(jià)提供了有力手段。

圖4 利用疏水相互作用固定底物和酶活性表征的過程[24]

圖5 DUB活性表征過程[28]

2 基于均相酶催化反應(yīng)

2.1 免標(biāo)記法

相比于非均相酶催化反應(yīng)，均相酶催化反應(yīng)更有利于底物和酶的接觸性。Ritorto等[28]用MALDI-TOF MS技術(shù)在體外分析了42個(gè)人泛素分解酶(DUB)對(duì)所有泛素拓?fù)洚悩?gòu)體(M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48和 K63-linked chains)的活性以及特異性，并篩選了DUB抑制劑。此方法以同位素標(biāo)記的N15-泛素為內(nèi)標(biāo)，對(duì)底物裂解的泛素單體進(jìn)行定量，得到了良好的線性關(guān)系(如圖5)。為減少干擾，在用MALDI-TOF MS檢測(cè)之前對(duì)酶進(jìn)行了去除。該方法免標(biāo)記、快速，適合于大量篩查酶活性。

2.2 反應(yīng)后產(chǎn)物標(biāo)記法

檢測(cè)復(fù)雜樣品如血液、細(xì)胞或組織中酶活性時(shí)，酶底物或產(chǎn)物的信號(hào)會(huì)被其他物質(zhì)所干擾，因此開發(fā)對(duì)特定底物或產(chǎn)物進(jìn)行分離富集以及選擇性定量分析，并能夠?qū)Χ喾N酶進(jìn)行同時(shí)分析的方法，對(duì)于酶活性評(píng)價(jià)和酶抑制劑篩選起著重要作用。Yang等[29]合成一種末端含有酰肼的氟化物探針，此探針與α-葡萄糖苷酶水解后的糖反應(yīng)，并通過與氟化金單分子層表面的氟相互作用而被固定，然后用MALDI-TOF MS進(jìn)行檢測(cè)并測(cè)定酶活性。采用此方法測(cè)定了兩種酶抑制劑的IC50值，證明該方法適用于酶抑制劑的篩選。然而在蛋白激酶催化過程中，由于反應(yīng)混合物中含有豐富的非磷酸化肽，會(huì)對(duì)磷酸化肽的信號(hào)產(chǎn)生，因此Lv等[30]在酶催化反應(yīng)之后，利用自制的二氧化鈦納米顆粒填充的毛細(xì)管柱，從復(fù)雜混合物中分離富集磷酸化肽，提高其信號(hào)強(qiáng)度。通過合成與底物肽分子量相似的肽段作為內(nèi)標(biāo)，定量分析了磷酸化效率。通過測(cè)定臨床治療慢性骨髓白血病的一種藥物(Abl的抑制劑)的IC50值，驗(yàn)證了MS方法的有效性。然后利用該方法篩選了實(shí)驗(yàn)室合成的6個(gè)該藥物類似物，得到的結(jié)果與酶聯(lián)法吻合。Deng等[31]開發(fā)了用于MALDI-TOF MS定量分析多種蛋白激酶活性的同位素二甲基標(biāo)記底物的方法。采用穩(wěn)定同位素二甲基標(biāo)記法，在一個(gè)MALDI靶點(diǎn)上實(shí)現(xiàn)了在單個(gè)和多重底物體系中，對(duì)不同反應(yīng)時(shí)間下蛋白激酶A(PKA)活性的監(jiān)測(cè)。此外，通過完整的標(biāo)記和精確的定量，可以準(zhǔn)確得到動(dòng)力學(xué)常數(shù)。該方法還成功地應(yīng)用于激酶抑制劑的篩選。因此，該方法能夠高通量、簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)有效和準(zhǔn)確地定量激酶和激酶抑制劑。Gregorius等[32]還提出了將金屬標(biāo)記肽用于多重酶活性測(cè)定。蛋白水解反應(yīng)后，利用絡(luò)合稀土金屬離子使胰蛋白酶酶解反應(yīng)后生成的剩余底物和肽產(chǎn)物形成金屬螯合物進(jìn)行標(biāo)記。使用MALDI質(zhì)譜對(duì)簡(jiǎn)單肽混合物進(jìn)行定量，或使用LC-MALDI質(zhì)譜對(duì)復(fù)雜底物混合物的標(biāo)記肽進(jìn)行定量，其準(zhǔn)確度高，動(dòng)態(tài)范圍寬(至少2個(gè)數(shù)量級(jí))，可用于監(jiān)測(cè)隨時(shí)間變化的產(chǎn)物形成和底物消耗過程。由于該方法具有多路復(fù)用能力和準(zhǔn)確性，在生物化學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

2.3 反應(yīng)前底物標(biāo)記法

除了對(duì)酶與底物反應(yīng)后的產(chǎn)物、剩余底物進(jìn)行標(biāo)記富集外，Ling等[33]報(bào)道了一種芘連接的底物肽，用于MALDI-TOF MS定量測(cè)定蛋白酶活性。該方法選擇了一個(gè)序列為GGGGRG的胰蛋白酶特異性肽段與芘結(jié)合，形成了芘連接肽探針Py-GGGGRG。在胰蛋白酶存在下，Py-GGGGRG探針可以特異性水解成Py-GGGGR。芘的引入大大提高了肽段的電離效率，由于底物和產(chǎn)物的分子量相似，可以直接通過底物和產(chǎn)物的強(qiáng)度比例進(jìn)行定量。并且利用芘的疏水性和共軛結(jié)構(gòu)，用聚苯乙烯涂層的MALDI板可選擇性地從復(fù)雜混合物中捕獲芘肽段。該方法的線性范圍寬，檢出限低，已成功地用于尿液中胰蛋白酶活性的定量測(cè)定和胰蛋白酶抑制劑的篩選。此外，還利用探針Py-GGGGGGYG對(duì)糜蛋白酶進(jìn)行了驗(yàn)證。該方法簡(jiǎn)單、高通量、定量準(zhǔn)確，在多種蛋白酶活性測(cè)定和特定肽序列篩選抑制劑方面具有很大的應(yīng)用潛力。眾所周知，MALDI-TOF MS技術(shù)由于基質(zhì)小分子干擾，在小分子區(qū)域酶底物或產(chǎn)物的測(cè)定方面受到限制。Wang等[34]報(bào)道了一種蒽醌-谷胱甘肽(Aq-ECG)探針，利用MALDI-TOF MS快速定量分析谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶(GGT)的活性(如圖6)。該探針是一種水溶性分子，由芳香蒽醌(Ag)和谷胱甘肽(ECG)通過一步硫醇-烯反應(yīng)共價(jià)連接。蒽醌部分的作用不僅是在GGT催化裂解后提高目標(biāo)離子的分子量，使目標(biāo)離子出現(xiàn)在較高的m/z區(qū)域，避免基質(zhì)離子的干擾，而且能顯著提高肽的電離效率。此外，磁性氧化石墨烯可以選擇性捕獲蒽醌部分，將目標(biāo)物與復(fù)雜混合物分離。使用一個(gè)蒽醌連接的甲基化谷胱甘肽作內(nèi)標(biāo)，可以定量分析GGT活性。利用該探針在健康人和肝癌病人血清樣本中能檢測(cè)到GGT，結(jié)果與酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定結(jié)果一致。該方法還成功地應(yīng)用于不同腫瘤、正常細(xì)胞內(nèi)源性GGT含量的檢測(cè)以及抗癌藥物丁酸鈉對(duì)GGT活性抑制作用的研究。利用該分子探針，開發(fā)了一種簡(jiǎn)單、靈敏、經(jīng)濟(jì)的方法，可以準(zhǔn)確定量地測(cè)定GGT活性并篩選其抑制劑或抗癌藥物。該方法也可改變探針部分，廣泛應(yīng)用于其他蛋白酶活性分析。

圖6 Aq-ECG和Aq-ECA的合成路線(A)以及基于Aq-ECG的酶活性分析方法流程圖(B)[34]

表1中對(duì)上述主要的方法進(jìn)行歸納總結(jié)，列舉了不同方法的基本原理、適用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)。

表1 酶活性分析方法性能的比較

3 結(jié)論與展望

綜上所述，由于MALDI質(zhì)譜的高通量、高耐鹽性等優(yōu)點(diǎn)使得其在酶活性分析和酶抑制劑篩選中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。與其他傳統(tǒng)分析方法相比，MALDI質(zhì)譜能夠直接檢測(cè)酶催化反應(yīng)的底物和產(chǎn)物的分子量信息，并且特別適用于多種酶的同時(shí)分析，在定性和定量分析方面均有廣泛的應(yīng)用前景。然而MALDI-TOF MS的重現(xiàn)性較差，用小分子有機(jī)基質(zhì)時(shí)，由于結(jié)晶不均勻，會(huì)導(dǎo)致響應(yīng)差異。基于MALDI-TOF MS的酶活性分析還需要提高底物或產(chǎn)物的離子化效率以及重現(xiàn)性，以提高酶活性分析的靈敏度以及定量準(zhǔn)確性。因此，開發(fā)更簡(jiǎn)單、快速、效率高的酶活性分析MALDI-TOF MS平臺(tái)在臨床檢測(cè)中具有重要意義。