基于化學衍生-質譜技術的生物與臨床樣本中核酸修飾分析

游雪嬌，袁必鋒，馮鈺锜

(武漢大學 化學與分子科學學院，生物醫學分析化學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430072)

核酸(DNA和RNA)中除了包括經典堿基，即腺嘌呤(Adenine，A)、鳥嘌呤(Guanine，G)、胞嘧啶(Cytosine，C)、胸腺嘧啶(Thymine，T)和尿嘧啶(Uracil，U)外，還包含許多化學修飾[1-3]。這些化學修飾不改變核酸的序列，但會改變其結構和生化特性，最終調節基因的時空表達[1-2,4]。

DNA胞嘧啶甲基化(5-Methyl-2′-deoxycytidine，5-mdC)是基因組DNA中研究最為廣泛的一種表觀遺傳修飾，研究證明5-mdC涉及調控基因表達、細胞分化、個體發育等多種重要生理功能[5]。近年來，在基因組DNA中發現了越來越多的修飾[6]。最近的研究表明，TET(Ten eleven translocation)蛋白能夠轉化5-mdC生成5-Hydroxymethyl-2′-deoxycytidine(5-hmdC)、5-Formyl-2′-deoxycytidine(5-fdC)，最后轉化為5-Carboxyl-2′-deoxycytidine(5-cadC)[7-8]。除DNA胞嘧啶甲基化外，還在真核細胞中發現了DNA腺嘌呤甲基化(N6-Methyl-2′-deoxyadenine，6mA)[9-10]。與5-mdC類似，DNA中的這些新修飾在多種生理過程的調節中起著關鍵作用[11]。

RNA是將DNA遺傳信息與蛋白質聯系起來的中間分子。鑒于DNA修飾的重要調節作用，最近對RNA可逆修飾的發現開啟了真核生物轉錄后基因調控的新時代[12]。細胞RNA中目前發現了超過150種結構不同的修飾類型[13-14]，其中大多數修飾是動態、可逆的，可調節RNA的結構和功能，從而影響基因的時空表達[15]。

DNA和RNA修飾在體內的豐度通常極低[16-17]。如哺乳動物mRNA中N3-Methylcytidine的含量可以低至每百萬個核苷僅含幾個修飾[18]。因此，高靈敏和特異的檢測方法對于剖析這些修飾的功能至關重要。新技術的發展在很大程度上促進和改變了表觀遺傳修飾領域。質譜(Mass spectrometry,MS)因具有高的靈敏度和選擇性，已成為最突出的核酸修飾分析技術之一[19-28]。然而，直接質譜分析對低豐度核酸修飾的鑒定和分析仍存在一些不足。

化學衍生能夠改變分析物的化學和物理性質，與質譜分析相結合可以改善分析對象的色譜分離和提高電噴霧電離(Electrospray ionization,ESI)-MS分析過程中的電離效率，最終提高分析物的檢測性能[29-33]。在過去的幾年中，本課題組以及其他研究者開發了多種基于化學衍生-質譜分析的方法對DNA和RNA修飾進行高靈敏和選擇性分析。本文總結了通過化學衍生-質譜分析方法破譯核酸修飾的最新進展，討論了這些分析方法的優缺點，并提供利用這些技術解決生物和臨床樣本中核酸修飾分析的典型例子。

1 基于化學衍生-質譜技術的核酸修飾分析

在過去的幾年中，化學衍生與質譜分析相結合的策略在很大程度上改善了DNA和RNA修飾的檢測，并促進了這些修飾的功能研究。本文基于分析衍生產物的質譜平臺，對化學衍生-質譜技術分析核酸修飾的方法進行如下分類：化學衍生結合液相色譜-質譜聯用(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)、化學衍生結合基質輔助激光解吸電離質譜(Matrix assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry,MALDI-MS)和化學衍生結合氣相色譜-質譜聯用(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)(圖1)。本文討論并總結了不同方法的優點和局限性。

圖1 化學衍生化-質譜分析核酸修飾的原理圖

1.1 化學衍生-LC-MS

1.1.1 DNA修飾除A，C，T，G和5-mdC之外，5-hmd因其重要的生理功能，被視為哺乳動物基因組的第6個堿基[34]。哺乳動物細胞基因組DNA中的5-hmdC含量低，LC-MS對5-hmdC的定量分析常受到高豐度正常核苷的離子抑制。為解決該問題，本課題組建立了一種新方法：使用T4β-葡萄糖基轉移酶選擇性地將葡糖基標記到5-hmdC的羥甲基中，形成更親水的產物，即β-Glucosyl-5-hydroxymethyl-2′-deoxycytidine(5-gmdC)[35]。在進行LC-MS分析前，通過NH2-二氧化硅的親水相互作用選擇性地富集5-gmdC，從而消除正常核苷的離子抑制，顯著提高了對5-hmdC的檢測靈敏度和準確度。利用已建立的方法，在3種培養的哺乳動物細胞和7種酵母菌株的基因組DNA中鑒定了5-hmdC修飾。

為了對植物DNA中可能存在的低含量5-fdC和5-cadC進行靈敏和定量分析，本課題組采用吉拉德試劑(吉拉德D、吉拉德T和吉拉德P)對5-fdC和5-cadC進行衍生化。吉拉德試劑含有易電離的叔胺或季銨，且能同時與5-fdC的醛基和5-cadC的羧基在溫和條件下反應(圖2)[36]。通過建立的高靈敏度檢測方法，在擬南芥和水稻基因組DNA中鑒定發現了5-fdC和5-cadC。此外，還發現干旱和鹽的環境脅迫可改變水稻基因組中5-fdC和5-cadC的含量，表明5-fdC和5-cadC在對環境脅迫的響應中起重要作用。但由于5-fdC和5-cadC的衍生化是依次進行的，這使得分析過程相對較為復雜。基于相似的原理，Hong等[37]通過含有季銨基團的吉拉德T試劑衍生來測定DNA中的5-Formyl-2′-deoxyuridine(5-fdU)。衍生化與LC-MS分析結合使5-fdU的檢出限(Limits of detection,LOD)達到3～4 fmol，這比直接質譜分析5-fdU的靈敏度提高了約20倍。

圖2 吉拉德試劑衍生化結合LC-MS分析方法測定植物基因組DNA中5-fdC和5-cadC的示意圖[36]

5-mdC及其氧化產物(5-hmdC、5-fdC和5-cadC)在DNA中的豐度差別很大，對這些胞嘧啶修飾進行同時定量檢測具有挑戰性。鑒于此，本課題組建立了2-Bromo-1-(4-dimethylaminophenyl)-ethanone(BDAPE)衍生結合LC-MS的分析方法，用于同時高靈敏測定4種胞嘧啶修飾(5-mdC、5-hmdC、5-fdC和5-cadC)[38]。衍生試劑BDAPE易與胞嘧啶的N3和N4位置反應，形成穩定的五元環結構，可實現這4種胞嘧啶修飾的同時衍生化。BDAPE含有一個疏水性的苯基和一個易帶電的叔銨基，衍生化后能顯著改善這些胞嘧啶修飾的液相色譜分離，并能顯著提高它們的質譜檢測靈敏度。經BDAPE衍生化后，這些胞嘧啶修飾的檢測靈敏度提高了35～123倍。利用此方法，成功定量了結直腸患者癌癥組織和癌旁組織中的5-mdC、5-hmdC、5-fdC和5-cadC。結果顯示，與癌旁組織相比，人的結直腸癌組織中5-hmdC、5-fdC和5-cadC的含量顯著降低，表明這些修飾在癌癥形成中具有潛在作用，這些修飾的減少可能是結直腸癌患者的一個普遍特征，暗示胞嘧啶修飾可作為早期診斷和預后的潛在生物標志物。由于鹽能夠造成胞嘧啶修飾的BDAPE衍生化效率降低，因此需通過固相萃取(Solid phase extraction,SPE)純化酶解消化的核苷從而去除鹽對衍生化反應的影響。

除BDAPE衍生化外，Guo等[39]最近使用4-(二甲基氨基)苯甲酸酐同時衍生DNA中4個胞嘧啶修飾(5-mdC、5-hmdC、5-fdC和5-cadC)的氨基，LODs為1.2～2.5 fmol。通過建立的方法，發現人乳腺癌組織中5-fdC和5-cadC的含量比相鄰的正常組織高。8-Nitroguanine(8-nitroG)是由過氧亞硝酸鹽在炎癥過程中產生的主要核酸損傷，是一種可評估炎癥相關癌變的潛在生物標志物。最近，Hu等[40]開發了一種6-Methoxy-2-naphthyl glyoxal hydrate(MTNG)衍生化結合在線SPE/LC-MS的策略分析8-nitroG。8-nitroG經MTNG衍生化后，通過在線SPELC-MS分析，檢測靈敏度提高約10倍。該方法用于定量測定8-nitroG的靈敏度高、可靠性好，可用于實驗室和臨床研究，以了解炎癥相關DNA損傷與癌變之間的關系。此外，由于MTNG可與8-nitroG以及其他鳥嘌呤化合物反應，因此需加入過量的MTNG并在質譜分析之前通過SPE除去過量的MTNG。

最近，Yu等[41]提出一類基于肼的衍生化試劑用于高靈敏分析胞嘧啶修飾。這類衍生化試劑含有一個反應基團肼基，以及一個疏水三嗪基和兩個易帶電荷的叔胺基用于調節衍生產物的疏水性。篩選出的基于肼的試劑能同時與5-fdC和5-cadC快速反應，使5-fdC和5-cadC的檢測靈敏度分別提高了125倍和100倍。使用該方法，5-fdC和5-cadC的LODs可低至10 amol和25 amol，實現了兩者的高靈敏定量檢測，該方法用600 ng基因組DNA便可同時檢測不同組織中的5-fdC和5-cadC，為珍貴樣品中5-fdC和5-cadC的分析提供了有效方法。

此外，Zhou等[42]使用氰基磷葉立德試劑(YC-CN)建立了一種有效的5-fdC衍生化方法，該方法利用YC-CN與5-fdC上醛基的Wittig反應，提出了一種基于光輔助三重多米諾反應策略，不僅能對5-fdC快速檢測，還能實現5-fdC和5-fdU的區分。通過該策略，能準確定量由γ輻射形成的5-fdC，表明該方法具有顯著的選擇性和敏感性。YC-CN的高反應活性和高效的光催化策略使其成為5-fdC的快速衍生化方法。這種Wittig啟動的共價標記策略為5-fdC的定性和定量檢測提供了一種新策略。此外，該研究也為從反應機理的角度區分5-fdC和5-fdU提供了新的思路。

1.1.2 RNA修飾除了氧化DNA中5-mdC生成5-hmdC，TET蛋白還可以催化RNA中的5-Methylcytidine(5-mrC)形成5-Hydroxymethylcytidine(5-hmrC)[43]。為探索RNA中5-hmrC的進一步氧化產物5-Formylcytidine(5-frC)，本課題組開發了氧化衍生化與質譜相結合的策略(Oxidation-derivatization combined with MS,ODMS)[44]。該策略使用MnO2將5-hmrC氧化成5-frC，產生的5-frC進一步用丹磺酰肼衍生化。5-frC中的醛基可以很容易與丹磺酰肼中的酰肼反應，產生具有易帶電的叔銨腙衍生物，從而能夠在LC-MS分析中提高5-frC的電離效率(圖3)。通過ODMS策略發現哺乳動物細胞RNA中存在5-frC。定量結果顯示RNA中5-frC的含量在HeLa細胞中為(9.0±1.2)/106rG，在HEK293T細胞中為(8.5±1.4)/106rG。此外，本課題組建立了2-Bromo-1-(4-diethylaminophenyl)-ethanone(BDEPE)衍生化與LC-MS相結合的分析方法，用于高靈敏和同時測定RNA中5-mrC的氧化產物[45]。結果表明，經BDEPE衍生化后，RNA中5-mrC、5-hmrC、5-frC和5-Carboxylcytidine(5-carC)的檢測靈敏度提高了70～313倍。使用該方法發現了哺乳動物RNA中存在5-carC。此外，還發現與癌旁組織相比，人結直腸癌組織和肝細胞癌組織中5-hmrC的含量顯著降低，表明RNA中5-hmrC在調控腫瘤的發生和形成中可能發揮一定作用。另外，使用建立的高靈敏分析方法探索了環境重金屬污染物(砷、鎘、鉻和銻)對核酸修飾的影響，發現小鼠胚胎干細胞DNA中的5-hmdC、5-fdC、5-cadC和RNA中5-hmrC、5-frC、5-carC的含量在重金屬處理后顯著降低，暗示重金屬可造成表觀遺傳修飾紊亂的新毒性機制[46]。

除化學衍生/LC-MS分析外，本課題組最近建立了一種吉拉德P試劑衍生化與管內固相微萃取以及LC-MS相結合的分析策略，用于高靈敏測定醛基化DNA和RNA修飾(圖4)[47]。攜帶負電的羧基填料可富集帶正電荷的衍生物，從而消除高豐度正常核苷的干擾，提高醛基化DNA和RNA修飾分析的檢測性能。使用該方法同時檢測了6種醛基化核苷，包括來自培養的哺乳動物細胞和多種哺乳動物組織DNA中的5-fdC和5-fdU，以及RNA中的5-frC、5-Formyluridine(5-frU)、2'-O-methyl-5-formylcytidine(5-frCm)和2'-O-Methyl-5-formyluridine(5-frUm)。該方法使醛基化核苷的檢測靈敏度提高了307～884倍。這是首次在培養的哺乳動物細胞和組織中發現5-frU、5-frCm和5-frUm。此外，還觀察到人甲狀腺癌組織RNA中的5-frC和5-frU以及DNA中的5-fdU的表達比癌旁組織高。結果顯示異常的DNA和RNA醛基化修飾可能參與腫瘤的形成和發展，同時暗示了DNA和RNA的醛基化修飾也可作為癌癥診斷的指標。但該方法需制備攜帶負電的填料，分析較為繁瑣，可能限制其在不同實驗室中的應用。

圖3 氧化衍生化結合LC-MS分析方法測定DNA中5-hmdC、5-fdC和RNA中5-hmrC、5-frC的示意圖[44]

圖4 吉拉德P試劑衍生化結合管內固相微萃取和LC-MS/MS分析方法測定DNA和RNA醛基化修飾示意圖[47]

與ESI-MS一樣，電感耦合等離子體質譜(Inductively coupled plasma-mass spectrometry,ICP-MS)也是核酸修飾研究中的有益工具。Wrobel等[48]提出了一種基于LC-ICP-MS靈敏檢測RNA中5-mrC的策略。該策略依賴于通過在順式二羥基核糖基團、鋨酸鉀(Ⅵ)二水合物(K2OsO2(OH)4)和四甲基乙二胺之間形成三元復合物在核糖上衍生鋨(Os)。該方法能實現對5-mrC的靈敏分析，其LOD可達21 pmol/L。

1.1.3 游離核苷/核苷酸修飾檢測生物體中的內源性修飾核苷可作為一種非侵入性的疾病診斷方法。為了實現生物體中修飾核苷的全面分析，本課題組建立了金屬氧化物分散SPE，隨后進行穩定同位素標記和雙中性丟失掃描質譜分析方法[49]。CeO2常被用于復雜生物樣品中核糖綴合物的選擇性捕獲[50-51]。富集的核苷可用丙酮和丙酮-D6進行衍生化，丙酮和丙酮-D6的衍生化產物在相同條件下被電離，但在質譜上單獨記錄，這可以顯著提高檢測特異性并促進對修飾核苷的鑒定。使用該方法在人尿液中鑒定出49種核糖綴合物，其中7種核糖綴合物的含量在健康組和淋巴瘤患者之間表現出明顯差異[49]，為尿液中修飾核苷的有效分析奠定了良好的基礎，同時為尿液中修飾核苷作為癌癥指標的應用提供了準確結果。此外，Li等[52]使用類似的策略鑒定了尿液樣本中的52種修飾核苷。由于該分析策略取決于攜帶順式二羥基的核糖核苷的富集，因此不能富集和檢測2'-O-甲基化核苷。

除甲基轉移酶介導的DNA和RNA甲基化外，甲基化的核苷酸可能在復制和轉錄過程中潛在地摻入DNA和RNA中。為了探索內源修飾核苷酸的存在，本課題組建立了N,N-二甲基對苯二胺(N,N-Dimethsyl-p-phenylenediamine，DMPA)衍生化與LC-MS結合的方法，可同時高靈敏測定5-Methyl-2'-deoxycytidine monophosphate(5-Me-dCMP)和5-Methylcytidine monophosphat(5-Me-CMP)等10種核苷酸(圖5)[53]。經過DMPA衍生化后，核苷酸的檢測靈敏度增加了88～372倍。采用該方法發現內源性的5-Me-dCMP和5-Me-CMP廣泛存在于培養的哺乳動物細胞、人組織和尿樣中。此外，還發現腎癌組織和淋巴瘤患者尿液中5-Me-dCMP和5-Me-CMP的含量與正常人相比明顯降低，暗示修飾核苷酸對癌癥基因異常調控具有潛在的作用。最近，本課題組進一步建立了8-(重氮甲基)喹啉衍生化結合LC-MS的分析方法，用于測定哺乳動物細胞和組織中內源性修飾的核苷三磷酸(Nucleoside triphosphates,NTP)(圖6)[54]。結果顯示，合成的8-(重氮甲基)喹啉可在溫和條件下與NTP的磷酸基團有效反應，所建立的方法能實現NTP的靈敏檢測，檢測靈敏度提高了56～137倍。通過該方法，在哺乳動物細胞和組織中鑒定了12種內源性修飾的NTP。此外，與癌旁組織相比，這些修飾的NTP在人肝細胞癌組織中的含量明顯降低。這些研究揭示了真核生物中廣泛存在修飾的NTP，為DNA和RNA的修飾提供了新來源。由于重氮基易降解，8-(重氮甲基)喹啉的穩定性較差，因此在進行衍生化反應時需要注意。

圖5 DMPA標記單磷酸核苷酸示意圖[53]

圖6 8-(重氮甲基)喹啉標記三磷酸核苷酸示意圖[54]

1.2 化學衍生-MALDI-MS

Pseudouridine(Ψ)是U的一種異構化修飾，也是RNA中的一種質量沉默修飾，難以通過常規的質譜檢測進行識別。為了解決該問題，Patteson等[55]開發了一種1-環己基-3-(2-嗎啉乙基)碳二亞胺(1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl) carbodiimide,CMC)衍生化方法，結合MALDI-MS分析，用于測定RNA中的Ψ。在CMC衍生化之后，每個Ψ有252 Da的質量增加，可通過MALDI-MS進行分析鑒定。為確定Ψ的序列位置，可將CMC衍生化前后的產物RNase T1消化后進行MALDI-MS分析。然而，由于CMC也能夠標記其它尿苷，這對分析含有許多尿苷殘基的RNA是不利的。該課題組通過優化反應時間、溫度、pH值和CMC與樣品的比例來改善CMC衍生化條件[56]。在優化的衍生化條件下，可降低由于不完全衍生化造成的假陽性。此外，這種方法還可為含有Ψ的特定小RNA提供信息[57]。

研究表明，Ψ中的N1位置處可被特異性氰乙基化[58]。與CMC衍生化相比，Ψ可以完全氰乙基化，而正常尿苷僅被標記約5%。這種方法能實現Ψ的一步衍生化，并且避免了對RNA骨架的破壞。Mengel-Jorgensen等[59]使用該衍生化策略并結合MALDI-MS分析了tRNA中的Ψ。Ψ的氰乙基化會產生53 Da的質量增加，因此很容易通過MALDI-MS檢測。通過該策略，研究者成功地鑒定了來自大腸桿菌的tRNATyrII中的一個Ψ位點。MALDI-MS與氰乙基化的組合成為基于質譜檢測Ψ的有效方法[59]。

1.3 化學衍生-GC-MS

氣相色譜-質譜被廣泛用于痕量化合物的測定。然而，DNA和RNA修飾不是揮發性的，不能通過GC-MS直接分析。因此，化學衍生化通常用于在GC-MS分析前將堿基/核苷轉化為揮發性衍生物。

Singer等[60]開發了一種檢測小牛胸腺、鮭魚精子和幾種小鼠組織的基因組DNA中5-Methylcytosine(5-mC)的方法。使用88%甲酸在180 ℃下將DNA水解成堿基，然后用雙(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(N,O-bis-(Trimethylsilyl)-trifluoroacetamide,BSTFA)衍生化堿基,得到的C和5-mC的衍生物可以很容易地被分離，且不會干擾其他正常堿基,該方法能檢測到DNA中低至1.6 pmol的5-mC。之后，Romerio等[61]引入了[2-13C]5-mC和[2-13C]C兩個同位素標記的內標，提供了基因組DNA中5-mC更準確的定量。該方法成功應用于外周血單核細胞DNA中5-mC的檢測。

本課題組采用GC-MS開發了一種用于研究酵母基因組DNA中5-mC[62]的高靈敏度分析方法，用88%甲酸水溶液在140 ℃下將提取的DNA水解成嘌呤和嘧啶，然后使用BSTFA和三甲基氯硅烷在乙腈中進行衍生化，5-mC的LOD達到0.8 pg(6.4 fmol)。并通過該方法，在19種酵母菌株中鑒定了5-mC，含量為0.014%～0.364%，表明酵母基因組中廣泛存在DNA胞嘧啶甲基化修飾。

2 結論與展望

最近的研究進展證明DNA和RNA修飾是動態、可逆的，這些修飾增加了核酸的多樣性，更重要的是，增加了生理過程中新的調節因子。對DNA和RNA修飾的功能研究為深入理解疾病的分子機制提供了有價值的信息，新技術和新方法的快速發展也極大地推動了核酸修飾的研究。

設計和使用適當的衍生化試劑以實現快速、高效和特異性衍生目標修飾對于將來探索核酸修飾的功能是非常重要的。但是基于化學衍生-質譜分析的方法也存在一定局限性，如副產物的形成和過量衍生化試劑引起的新問題。因此，仍需開發新的衍生化試劑和衍生化反應，以便通過質譜進行高靈敏和選擇性地檢測核酸修飾。通過分析DNA和RNA修飾的化學結構可為設計合適的衍生化試劑提供有用的指導。新衍生化試劑和衍生化反應的發展可能會有助于發現新的DNA和RNA修飾，這也將為核酸修飾與疾病相關研究提供新線索。除了破譯核酸修飾外，化學衍生與質譜分析技術相結合還可以擴展到如蛋白質組學研究、代謝組學研究和質譜成像等各種研究領域。