高壓氧對老年腦缺血大鼠血清心型脂肪酸結合蛋白含量的影響及機制

郭知偉 陳玉軍 王寶慶 張金浩 姜建強

(齊齊哈爾醫學院附屬第一醫院神經外科，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

多源性小細胞是脂肪酸結合蛋白(FABP)的主要組成成分，腦部組織中主要包括心型FABP(hFABP)及腦型FABP兩種，在腦梗死等嚴重的心血管疾病發生的過程中常常伴隨神經細胞的損傷甚至死亡，細胞內hFABP釋放入血引起血清中含量升高。研究表明，在缺血后再灌注的發生過程中常常伴隨結合蛋白含量的改變〔1〕，本文探究缺血再灌注過程損傷與蛋白含量改變之間的相關性，分析高壓氧(HBO)對老年腦缺血大鼠血清hFABP含量的影響及機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 購自上海實驗動物有限公司的老年大鼠180只，納入標準：(1)均統一采購，經專門企業培養；(2)生活環境及飲食條件完全相同。排除標準：(1)體重嚴重偏離平均體重；(2)伴有病菌感染等疾病〔2〕。隨機分為研究組和對照組，研究組90只，其中雌性45只，雄性45只，月齡19～21個月，平均月齡(20.5±0.2)個月；對照組90只，雌性43只，雄性47只，月齡19～22個月，平均月齡(20.7±0.3)個月，兩組一般資料差異不存在統計學意義(P>0.05)。

1.2血清hFABP含量檢測 分別于兩組大鼠接受HBO治療前后抽取其空腹血液，樣本抽取結束保存在加有抗凝劑的無菌管中，血量為5 ml，隨后在1 500 r/min的條件下進行離心并將血清保存于-80℃的條件下備用，應用hFABP試劑盒(上海恒遠有限公司)進行雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，操作過程嚴格按照說明書進行〔3〕。

1.3腦組織小窩蛋白-2及基質金屬蛋白酶(MMP)-2檢測 測定均通過免疫印跡法，具體為：首先對大鼠進行深度麻醉，用低溫下的磷酸鹽緩沖液(PBS)進行心臟灌流，隨后選取缺血再灌注段的腦組織微血管并采用裂解液制作勻漿，隨后在4℃、轉速為15 000 r/min的條件離心并對上清液進行蛋白測定，蛋白測定的方法為考馬斯亮藍G-250結合定量法〔4〕。具體操作為在體積分數為10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離不同分子質量及電荷量的蛋白質，隨后將不同條帶轉移至分別含有腦組織小窩蛋白-2及MMP-2抗體的硝酸纖維素薄膜上孵育過夜，在計算機軟件下進行蛋白分離結果的掃描，根據條帶的光密度值測定其含量〔5〕。

1.4血腦屏障(BBB)通透性檢測 通過伊文思蘭測定腦組織，具體操作嚴格按照說明書進行〔6〕。

1.5再灌注模型建立 再灌注模型的建立方法為大腦中動脈線栓法，具體為：使用10%的水合氯醛進行腹腔注射以麻醉大鼠〔7〕。麻醉成功后切開其左側頸部使頸總動脈充分暴露，最后使用剝離分針分離此處的迷走神經，分離結束后進行翼腭動脈及頸外動脈的結扎，隨后借助末端較為圓潤的尼龍絲分別經過頸外動脈及頸內動脈置入大腦前部的交通動脈內，插入深度為120～200 cm，具體的深度根據大鼠的體重及頭部體積等具體調整，插入后即達到阻塞大腦動脈右側血液供應的目的，堵塞時間為2 h左右，拔出尼龍線即完成再灌注模型的建立〔8〕。

1.6腦梗死體積測定 大鼠接受HBO治療后采用頸部折斷法處死并采集腦組織，隨后制成厚度為2 mm左右的切片〔9〕。將切片置于1.2%的氯化三苯基四氮唑磷酸鹽緩沖液中，在37℃的條件下恒溫保存30 min，分別置于藍色背景中進行拍照并利用HPIAS-1000圖像分析系統測量計算梗死體積百分比〔10〕。

1.7再灌注過程死亡率及腦組織損傷率發生 腦組織損傷率通過梗死體積的變化進行衡量，損傷率=腦梗死面積增大只數/總只數〔11，12〕。

1.8統計學方法 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗及χ2檢驗。

2 結 果

2.1兩組治療前后血清hFABP含量比較 治療后研究組血清hFABP含量明顯高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組治療前后血清hFABP含量對比

與治療前比較：1)P<0.05，表2、表3同

2.2兩組腦組織小窩蛋白-2及MMP-2表達對比 治療后研究組腦組織小窩蛋白-2、MMP-2表達明顯高于對照組(P<0.05)，見表2和圖1。

表2 兩組相關蛋白表達對比

1.對照組治療前；2.研究組治療前；3.對照組治療后；4.研究組治療后圖1 治療前后兩組腦組織小窩蛋白-2、MMP-2表達

2.3兩組BBB通透率對比 治療后研究組BBB通透率明顯小于對照組(P<0.05)，見表3。

表3 兩組BBB通透率對比

2.4再灌注過程中兩組死亡率對比 研究組再灌注死亡率〔13只(14.4%)〕明顯小于對照組〔21只(23.3%)，χ2=4.892,P<0.05〕。

2.5再灌注過程兩組腦組織損傷率對比 研究組腦組織損傷率明顯低于對照組(P<0.05)，見表4。

表4 再灌注過程中兩組腦組織損傷率對比〔n(%),n=90〕

3 討 論

疾病的早發現早治療能夠明顯優化患者的疾病治療效果，提高生存率〔13〕。對于腦梗死等惡性疾病可以通過血管的疏通協調全身的血液流動狀況，但是在搶救過程中的再灌注損傷率使疾病的治療效果大大下降，因此做好疾病治療的監控工作，可有效避免再灌注給患者生命健康帶來的威脅〔14〕。本研究結果說明HBO治療能夠通過減少患者的腦梗死面積，提高機體血液的流通程度優化疾病治療效果。

研究表明，HBO能夠大大降低BBB通透性，進一步引起腦部血流量的下降，減少腦組織內對于水分的吸收，防止腦部組織在高滲環境下出現腦水腫〔15〕。本研究結果說明HBO進行再灌注過程中的機制是改變BBB之間的通透性，維持正常的滲透壓平衡。毛細血管內皮細胞、基膜及星形膠質細胞的突觸是BBB的主要組成成分，是中樞神經系統與外界環境之間的重要屏障。BBB的功能下降甚至喪失是腦缺血再灌注損傷發生時的主要病理學基礎，經典的跨膜轉運是細胞質膜微囊介導的主要途徑，腦組織蛋白也是腦內參與物質及信息傳遞的重要物質，參與多類心血管疾病的發生過程〔16〕。

hFABP屬于脂肪酸家族的成員之一，是FABP3 基因的重要表達產物，心肌細胞是其主要分布的部位，在細胞質中所占的比重為10%左右，是脂肪酸轉運過程的重要參與者，機體任何組織出現缺血損傷后會伴隨此類蛋白血清含量的異常升高。本研究結果說明，應用HBO進行輔助治療能夠明顯改善組織及細胞的供氧能力，最大程度減少細胞凋亡的發生概率，改善血清hFABP水平。MMP-2廣泛分布于機體的各類細胞和組織中，其含量與患者缺血時間之間存在較大的相關性，研究表明正常腦組織中此類蛋白表達量極低甚至無表達〔17〕。本研究結果說明，HBO能夠通過改善機體MMP-9含量及活性減少再灌注過程中的損傷。

綜上，在大鼠腦缺血再灌注過程中會伴隨體內hFABP含量升高，但在再灌注過程中輔助HBO治療能夠明顯減少再灌注過程中的損傷，降低死亡率，利于臨床上的再灌注診斷及再灌注損傷情況的監控，通過動物模型的建立能夠為臨床心血管疾病的診斷及監控治療提供建設性建議，可行性較高。