黃芪多糖對CPZ誘導的急性脫髓鞘模型的保護作用

邢雁霞 李自青 劉斌焰 趙一錦 章培軍 劉斌鈺 馬存根

(1大同大學醫(yī)學院腦科學研究所，山西 大同 037009；2山西中醫(yī)藥大學“2011”協(xié)同創(chuàng)新中心)

少突膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中一群高度分化的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，其主要功能是在軸突周圍形成緊密的多層髓鞘，維持神經(jīng)元軸突的存活和正常功能。少突膠質(zhì)細胞分化不良或受損后影響髓鞘的正常功能，導致CNS脫髓鞘疾病，如多發(fā)性硬化(MS)〔1〕。雙環(huán)己酮草酰二腙(CPZ)是一種銅離子螯合劑，小劑量CPZ能特異性誘導少突膠質(zhì)細胞死亡，引發(fā)CNS脫髓鞘，但對神經(jīng)元的影響較小〔2〕。中醫(yī)學認為脫髓鞘疾病屬于“痿癥”的范疇，治療以補氣為主。黃芪具有益氣扶正，養(yǎng)陰生津，補氣升陽，益衛(wèi)固表等作用，其主要化學成分為黃芪多糖(APS)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖具有提高機體免疫功能、增強耐力、延緩衰老等作用〔3～6〕，黃芪糖蛋白能通過抗炎和免疫調(diào)節(jié)機制減輕實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎(EAE)小鼠髓鞘的脫失，促進神經(jīng)修復〔7,8〕。目前對于APS不涉及免疫調(diào)節(jié)的機制下治療脫髓鞘疾病，國內(nèi)未見有報道。本實驗主要觀察APS對CPZ誘導的急性脫髓鞘小鼠的神經(jīng)保護作用，探討其治療髓鞘脫失疾病的可能性。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1動物 8周齡雌性C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，體重18～22 g，健康清潔級，飼養(yǎng)于大同大學腦科學研究所實驗動物中心，實驗前小鼠在無病原菌動物房自由飲食喂養(yǎng)1 w。

1.1.2試劑 APS(S31346)和CPZ(S30349)均購自北京博揚宏達科技有限公司；大鼠抗小鼠MBP單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)(550280)購自英國AbD Serotec公司；Alexa Fluor 488 熒光標記的二抗(#4416S)購自美國Cell Signaling公司。

1.1.3儀器 日本Olympus 熒光顯微鏡(BX51)；德國Leica冰凍切片機(CM1950)；北京賽多利斯天平有限公司電子天平(BS210S)。

1.2方法

1.2.1模型制備與給藥 通過含0.2%CPZ的混合飼料連續(xù)喂食小鼠來誘導建立脫髓鞘模型〔9〕。54只小鼠隨機分為三組：正常組，CPZ組，APS組，每組18只，每組根據(jù)觀察時間(4、5和6 w)分為三個亞組，每個亞組6只。正常組小鼠采用普通飼料飼養(yǎng)，CPZ組和APS組小鼠食用含有0.2% CPZ的特殊飼料，持續(xù)喂養(yǎng)6 w。從第2周開始，APS組按500 mg/(kg·d)腹腔注射APS，CPZ組給予等量生理鹽水，持續(xù)給藥至實驗結束。

1.2.2標本制備 實驗第4、5和6周末，各組取6只小鼠采用0.3 g/L戊巴比妥鈉按0.2 ml/只 腹腔注射麻醉后，采用40 g/L多聚甲醛灌注進行組織固定，小心剝?nèi)∧X組織，取4只用最佳切削溫度化合物(OCT)包埋后制成7 μm冷凍切片，用于髓鞘固藍(LFB)染色和免疫熒光組化染色；剩余2只常規(guī)做石蠟包埋并切片，用于蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.2.3髓鞘染色 采用LFB染色法顯示髓鞘，配制LFB染液〔8〕，將腦組織切片在95%乙醇溶液中浸泡15 min后，轉入LFB染液37℃過夜，95%乙醇和雙蒸水漂洗，0.05%碳酸鋰溶液分化，70%乙醇分色，蒸餾水終止分色，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。鏡下觀察，用 Image-Pro Plus6.0 軟件計算腦組織染色平均光密度值。

1.2.4免疫熒光組織化學染色 取腦組織冰凍切片置室溫下晾干，先用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，5 min/次；用1%胎牛血清白蛋白(BSA)以1∶1 000的比例稀釋髓鞘堿性蛋白(MBP)一抗抗體，4℃冰箱中孵育過夜；次日再用PBS洗3次，5 min/次，濾紙吸干，加入Alexa Fluor 488熒光標記的二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h；PBS洗3次，5 min/次。再加入染核液(1∶1 000)室溫孵育5 min，PBS洗3次，5 min/次，甘油封片，熒光顯微鏡觀察每個切面腦組織MBP陽性細胞熒光強度，用Image-Pro Plus 6.0 軟件統(tǒng)計。

1.2.5HE染色 常規(guī)做小鼠腦組織石蠟包埋并切片，每張切片厚度為5 μm，HE染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察腦組織形態(tài)學變化，并用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析每個切面腦組織小膠質(zhì)細胞的數(shù)量。

1.2.6小鼠體重、進食量和全腦重量檢測 實驗開始為每只小鼠放入相應飼料10 g，以后每天固定時間記錄放入籠中的新鮮飼料重量和剩余飼料重量；實驗期間每隔1 d給小鼠稱重并記錄，在喂養(yǎng)4、5和6 w末將小鼠麻醉取腦，置于稱量杯中用電子天平稱出腦濕重，根據(jù)腦組織重量計算臟器系數(shù)(臟器系數(shù)=臟器重量/體重×100%)。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.5軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1APS對CPZ小鼠體重的影響 采用CPZ造模前三組小鼠體重無顯著差異(F=1.05，P=0.364)。造模第1周末CPZ組與APS組小鼠體重均減輕，與正常組小鼠體重比較有顯著差異(F=3.46，P=0.046)；但兩組間比較無明顯差異(P>0.05)；第2～6周正常組小鼠體重呈逐漸增加的趨勢，且明顯高于APS組、CPZ組(P<0.05，P<0.001)；CPZ組小鼠體重低于APS組(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。見表1。

表1 三組造模前及造模后不同時間體重比較

與正常組比較：1)P<0.05,2)P<0.001；與APS組比較：3)P<0.05，4)P<0.01,5)P<0.001

2.2APS對CPZ小鼠進食量的影響 造模前三組小鼠的進食量無顯著差異(F=2.593，P=0.093)。造模第2～6周，與正常組相比，CPZ組和APS組小鼠進食量均明顯降低(F=71.71、89.33、82.85、69.41、80.12，均P<0.001)，且CPZ 組小鼠進食量明顯低于APS組小鼠(P<0.001)。見表2。

表2 三組造模前及造模后不同時間進食量比較

與正常組比較：1)P<0.001,與APS組比較：2)P<0.001，下表同

2.3APS減輕CPZ小鼠髓鞘的脫失 用LFB染色法觀察5 w末小鼠腦組織髓鞘變化：正常組小鼠腦組織LFB染色后呈深藍色，致密均勻，OD值為(0.29±0.024)，顯著高于CPZ組和APS組(0.16±0.018，0.23±0.019，P<0.001)。CPZ組染色明顯變淺，呈現(xiàn)淡藍色塊狀，APS有效改善了髓鞘脫失，APS組與CPZ組比較差別有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見圖1。

圖1 3組腦組織LFB髓鞘染色(×200)

2.4APS促進CPZ小鼠腦組織MBP的表達 免疫熒光組化雙染法觀察造模后4～6 w小鼠腦組織MBP的表達，實驗結果發(fā)現(xiàn)：正常組小鼠腦胼胝體切片中MBP陽性纖維完整、無損失；CPZ組顯示明顯而廣泛的髓鞘損傷，MBP陽性纖維斷裂以造模后5 w最為明顯，MBP的表達量明顯下降；APS組可見有完整的MBP陽性纖維及結構重建，提示APS能促進髓鞘的再生修復(圖2～4)。對MBP平均熒光強度進行IOD值的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)：與正常組相比，CPZ 組和APS組小鼠的IOD值明顯下降(P<0.001)；APS組小鼠IOD值明顯高于CPZ模型組(P<0.001)，APS明顯促進了CPZ小鼠髓鞘的再生修復。見表3。

圖2 造模后4 w 3組小鼠腦組織MBP的表達(免疫組化，×400)

圖3 造模后5 w 3組小鼠腦組織MBP的表達(免疫組化，×400)

圖4 造模后6 w 3組小鼠腦組織MBP的表達(免疫組化，×400)

2.5APS對CPZ小鼠腦組織形態(tài)學的影響 造模后4～6 w腦組織石蠟切片HE染色可見正常組小鼠有成熟的神經(jīng)元，且分布均勻，小膠質(zhì)細胞分布較少；CPZ組小鼠小膠質(zhì)細胞聚集，數(shù)量明顯增多，5 w達高峰，神經(jīng)元排列紊亂，空泡形成；APS組神經(jīng)元病理性損傷減輕，小膠質(zhì)細胞數(shù)量較CPZ組減少(P<0.001)，見圖5，表4。

表3 造模后不同時間APS增加CPZ小鼠腦MBP的表達

與正常組比較：1)P<0.001；與APS組比較：2)P<0.001

圖5 3組造模后不同時間腦組織形態(tài)學改變(HE ×400)

表4 造模后不同時間APS減少CPZ小鼠腦組織小膠質(zhì)細胞數(shù)

與正常組比較：1)P<0.001；與APS組比較：2)P<0.05，3)P<0.001

2.6APS對CPZ小鼠臟器系數(shù)的影響 各組組間造模后4、5、6 w全腦重量比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)，見表5。

表5 造模后不同時間APS對CPZ小鼠腦重量的影響

與正常組比較：1)P<0.01,與CPZ組比較：2)P<0.05,3)P<0.01

4～6 w各組臟器系數(shù)分別為：正常組1.52±0.99、1.45±0.87和1.41±0.79；CPZ組2.07±0.64、1.99±0.89和1.98±0.69；APS組1.79±0.59、1.70±0.67和1.68±0.76。各組組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。APS增加了CPZ小鼠腦重，降低了臟器系數(shù)。

3 討 論

CPZ是Cu2+螯合劑，含Cu2+的輔酶在細胞內(nèi)濃度極為有限，如干擾Cu2+在細胞內(nèi)濃度的穩(wěn)定性可導致神經(jīng)變性，小劑量(0.2%)CPZ通過干擾Cu2+對酶抑制而產(chǎn)生神經(jīng)毒性。CPZ作用于C57BL/6小鼠可明顯誘導其CNS少突膠質(zhì)細胞凋亡，引起髓鞘脫失〔10〕。利用這一特性，CPZ可用于建立MS等脫髓鞘疾病的動物模型，該模型的優(yōu)勢是與MS復發(fā)緩解的病理特點相似，可從髓鞘的脫失和再生角度對疾病進行模擬。

小鼠的體重變化和進食量可反映機體的整體狀態(tài)和疾病的進展程度，腦臟器系數(shù)則較好地反映了CPZ對腦的毒性作用及APS的干預效應。體重減輕可能與CPZ導致小鼠攝食能力的下降和病情有關；進食量減少是CPZ的味道不佳，還是抑制攝食中樞或病情所致有待進一步研究。本研究結果，提示APS可減輕CPZ的毒性作用，保護腦組織。中醫(yī)認為MS是“痿證”，明·方隅《醫(yī)林繩墨》認為“痿者，氣之軟弱也……，氣虛血瘀證”；《內(nèi)經(jīng)》言調(diào)理氣血應“疏其氣血，令其調(diào)達，以致和平”，故中醫(yī)理論認為補益氣血可改善MS患者的臨床癥狀。黃芪無論從傳統(tǒng)用藥還是現(xiàn)代應用，均顯示出良好的補益氣血作用，APS是黃芪的有效單體成分，具有廣泛的藥理作用，如神經(jīng)保護功能、對抗氧化應激誘導的神經(jīng)變性及提高記憶力等，由此推測APS通過健脾補氣增加小鼠進食量、體重和機體耐力。

MS的脫髓鞘和神經(jīng)變性病變與小膠質(zhì)細胞活化有關。一般情況下，不活化的小膠質(zhì)細胞有助于神經(jīng)元室內(nèi)穩(wěn)態(tài)。過度活化的小膠質(zhì)細胞通過產(chǎn)生活性氧(ROS)和活性氮(RNS)，誘導線粒體功能障礙，進而直接損傷少突膠質(zhì)細胞前體細胞和神經(jīng)元〔11，12〕。給予小鼠含cuprizone 的飼料2 w后，腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞聚集，第3周髓鞘脫失顯著且小膠質(zhì)細胞聚集數(shù)量增加，4～6 w病變達高峰〔13〕。Lindner等〔14〕將17β-雌二醇給予CPZ模型小鼠時，小膠質(zhì)細胞活化的延遲，髓鞘脫失減輕。Millet等〔15〕研究報道表明注射蛋白酶體抑制劑乳胞素，可促進CPZ小鼠髓鞘再生，并伴有小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞數(shù)量減少。體內(nèi)給予小膠質(zhì)細胞活化抑制劑米諾環(huán)素可抑制小膠質(zhì)細胞的活化與增殖，阻止cuprizone引起的脫髓鞘〔13〕。本實驗可見小膠質(zhì)細胞在cuprizone 引起的脫髓鞘動物模型中具有有害作用，抑制小膠質(zhì)細胞的聚集與活化可減少髓鞘脫失，促進髓鞘再生。

本實驗LFB 染色顯示CPZ組小鼠髓鞘染色變淺、斷裂或缺失，提示造模成功；APS組小鼠髓鞘脫失減輕，證實APS有不同程度的髓鞘修復作用。MBP是CNS髓鞘的主要蛋白質(zhì)，用于評價髓鞘的形成和發(fā)展，判斷神經(jīng)損傷的嚴重程度、損傷范圍的指標〔16〕。MBP染色顯示CPZ組小鼠MBP陽性纖維有明顯而廣泛的斷裂，MBP的表達量顯著下降，以造模后5 w最為明顯；APS組小鼠腦組織有完整的MBP陽性纖維及結構重建，提示APS能促進髓鞘的再生修復。綜上，APS對CPZ誘導的急性脫髓鞘小鼠具有較好的神經(jīng)保護作用。