絲膠蛋白對2型糖尿病大鼠腎臟氧化應激損傷和PI3K/Akt信號通路的影響

張雷 李東哲 陳志宏

(承德醫(yī)學院，河北 承德 067000)

氧化應激在很多疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，包括腫瘤、高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化、慢性疲勞綜合征、神經(jīng)組織退化性疾病等〔1〕。并且，越來越多的證據(jù)表明，氧化應激在糖尿病腎臟損傷的發(fā)病中亦發(fā)揮著重要作用〔2,3〕。有研究報道，氧化應激的過程涉及多種信號轉(zhuǎn)導通路，包括核因子E2相關(guān)因子2-Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1-抗氧化反應序列元件(Keap1-Nrf2-ARE)信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路、Toll樣受體(TLRs)介導的信號通路等〔4〕。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，絲膠(彩色蠶繭水提物)具有保護糖尿病時腎臟損傷的作用〔5〕，但具體的作用機制還需要進一步地深入探討。本研究旨在探討絲膠蛋白對2型糖尿病大鼠腎臟氧化應激損傷和PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 ①實驗動物：購買自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司的SD大鼠48只，健康清潔級，大鼠合格證號：SCXK(京)2012-0001。②絲膠：1%的Na2CO3浸泡30 min(蠶繭:Na2CO3為1∶30)，95～100℃沸煮3 h提取2次，合并2次提取液并減壓濃縮，濃縮液裝入8 000～14 000 nm透析袋透析過夜，透析液冷凍干燥成粉末即為絲膠。③實驗試劑：鏈脲佐菌素，美國Sigma公司；大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、總一氧化氮合酶(tNOS)、過氧化氫(H2O2)檢測試劑盒，南京建成生物科技有限公司；Trizol，北京茂建聯(lián)科技有限公司；DNA marker，天根生化科技(北京)有限公司；PCR引物，寶生物工程(大連)有限公司。

1.22型糖尿病大鼠模型的建立及絲膠干預 采用隨機的方法將48只大鼠均分為四組各12只，正常對照組(對照組)、2型糖尿病模型組(模型組)、絲膠低劑量組、絲膠高劑量組。采用高脂高糖飼料飼養(yǎng)+鏈脲佐菌素(35 mg/kg，2次)腹腔注射的方法建模，空腹血糖≥11.1 mmol/L為建模成功的標準。待建模成功后，絲膠低劑量組大鼠連續(xù)35 d按照1.8 g/(kg·d)的劑量灌胃絲膠；絲膠高劑量組大鼠連續(xù)35 d按照2.4 g/(kg·d)的劑量灌胃絲膠；模型組大鼠連續(xù)35 d以等量生理鹽水灌胃。

1.3取材 各組大鼠用藥結(jié)束后禁食12 h，使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，開胸于心臟取血后斷頭處死，取腎臟于冰盤上切成小塊后入液氮中速凍，然后移入-80℃低溫冰箱保存。

1.4檢測大鼠血液指標 所取大鼠血液于4℃、3 000 r/min離心15 min，使用全自動生化分析儀分別檢測血糖，血尿素氮和肌酐水平。

1.5檢測大鼠腎臟氧化應激相關(guān)指標 取出低溫保存的腎臟，按照試劑盒說明將腎臟組織勻漿、離心后取上清，檢測腎臟組織中SOD、CAT、tNOS和H2O2的水平。

1.6檢測大鼠腎臟PI3K和Akt mRNA的表達 提取腎臟組織的總RNA，測定RNA的濃度和純度并進行鑒定，然后將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存于-20℃環(huán)境備用。以cDNA為模板，使用Real Time Q-PCR法擴增PI3K、Akt和GAPDH的片段，每個指標重復3次，以GAPDH為內(nèi)參采用2-△△Ct法計算所得數(shù)據(jù)，作為目的mRNA的相對表達水平。

引物序列(5′-3′)：PI3K：正義鏈-CCAGAAGAAGGGACAGTGGTATG，反義鏈-TCGTAGCCAATCAGGGAGGT，產(chǎn)物大小183 bp；Akt：反義鏈-ATGGACTTCCGGTCAGGTTCA，反義鏈-GCCCTTGCCCAGTAGCTTCA，產(chǎn)物大小126 bp；GAPDH：正義鏈-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG，反義鏈-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA，產(chǎn)物大小143 bp。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析，LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組血糖、血尿素氮、肌酐水平比較 模型組血糖、血尿素氮、肌酐水平較對照組明顯提高(P<0.01)。絲膠低、高劑量組血糖、血尿素氮、肌酐水平明顯低于模型組(P<0.01)；且絲膠高劑量組血尿素氮水平明顯低于絲膠低劑量組(P<0.01)。見表1。

表1 各組血糖、血尿素氮、肌酐水平比較

與對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；與絲膠低劑量組比較：3)P<0.01

2.2各組腎臟SOD、CAT、tNOS、H2O2水平比較 模型組腎臟SOD、CAT水平較對照組明顯降低，tNOS、H2O2水平較對照組明顯升高(P<0.01)。絲膠低、高劑量組腎臟SOD、CAT水平明顯高于模型組，tNOS、H2O2水平明顯低于模型組(P<0.01)；并且，絲膠高劑量組腎臟CAT水平明顯高于低劑量組，H2O2水平明顯低于低劑量組(P<0.01)。見表2。

2.3各組腎臟PI3K和Akt mRNA表達比較 模型組腎臟PI3K、Akt mRNA表達較對照組明顯降低(P<0.01)。絲膠低、高劑量組腎臟PI3K、Akt mRNA表達明顯高于模型組(P<0.01，P<0.05)；且絲膠高劑量組腎臟PI3K mRNA表達明顯高于低劑量組(P<0.01)。見表2。

表2 各組腎臟SOD、CAT、tNOS、H2O2及PI3K、Akt mRNA水平比較

與對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05；與絲膠低劑量組比較：4)P<0.01

3 討 論

目前，糖尿病腎臟損傷的致病機制并不十分清楚，研究者們認為系多因素參與、在一定的遺傳背景和危險因素的共同作用下致病，包括腎臟血流動力學異常、高血糖造成的代謝異常、高血壓、血管活性物質(zhì)代謝異常、炎癥、氧化應激損傷等〔2，3，6，7〕。氧化應激時活性氧(ROS)和活性氮(RNS)產(chǎn)生過多，體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導致組織損傷。ROS包括超氧陰離子(·O2-)、羥自由基(·OH)和H2O2等；RNS包括一氧化氮(NO)、二氧化氮(NO2)和過氧化亞硝酸鹽(ONOO-)等。由于NO的半衰期極短，一氧化氮合酶(NOS)是NO生成的主要限速酶，而NOS的性質(zhì)相對穩(wěn)定，因此目前常通過檢測NOS代表NO的水平〔8〕。同時，機體存在兩類抗氧化系統(tǒng)，酶抗氧化系統(tǒng)和非酶抗氧化系統(tǒng)，其中的酶抗氧化系統(tǒng)主要包括SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶等。ROS除了可直接損害組織細胞，還能激活多種氧化應激通路和抗氧化應激通路，從而間接加重或減輕組織細胞的損傷，其中即包括PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路。

本研究結(jié)果說明在成功建立糖尿病大鼠模型的同時，模型大鼠亦出現(xiàn)了腎臟損害；氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡導致的氧化應激和PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路異常參與了糖尿病時腎臟損傷的病理過程。眾所周知，高血糖會增加ROS的產(chǎn)生，導致氧化應激〔9，10〕。而增加的ROS可通過使腎足細胞凋亡增加破壞腎濾過膜的完整性或通過激活多種炎癥相關(guān)通路導致細胞外基質(zhì)過度積聚，從而造成腎臟損害〔11〕。PI3K/Akt信號通路存在于高等真核生物所有細胞中并高度保守，該途徑涉及的關(guān)鍵因子包括PI3K和Akt，PI3K被磷酸化后激活Akt，從而介導細胞存活、生長、增殖、遷移和血管生成等多種生物學作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路與氧化應激密切相關(guān)，PI3K/Akt信號通路被激活可減少氧化應激導致的細胞凋亡，并對H2O2誘導的腎近端小管細胞凋亡具有保護作用〔12，13〕。

本研究考慮絲膠可能通過以下機制發(fā)揮保護糖尿病時腎臟損傷的作用：①絲膠可減少氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生及提高抗氧化酶的活性，恢復氧化作用與抗氧化作用之間的平衡，從而減輕氧化應激造成的損傷；②絲膠可能通過激活PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路，進而減少氧化應激導致的細胞凋亡等，保護腎功能。并且，絲膠對糖尿病時腎臟損害的保護作用具有一定的劑量依賴性，但絲膠發(fā)揮保護作用的最佳劑量尚待深入研究確定。

絲膠是從彩色蠶繭中提取的水溶性蛋白，最早《本草綱目》記載蠶繭煮水可治“消渴”，我國民間當代亦有蠶繭泡水輔助降糖的驗方。本研究亦證實，絲膠具有保護糖尿病時腎臟損傷的作用。