七氟烷與異氟烷麻醉對腦膠質(zhì)瘤患者外周血細(xì)胞因子的影響

姜虹宇 呂憶松 張桂運 韓驄 徐遠(yuǎn)志 時飛

(1無錫第三人民醫(yī)院麻醉科，江蘇 無錫 214000；上海交通大學(xué) 2繼續(xù)教育學(xué)院；3附屬第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科)

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤屬惡性實體瘤〔1〕，預(yù)后極差。目前，膠質(zhì)瘤標(biāo)準(zhǔn)化治療方案為手術(shù)切除聯(lián)合放、化療，即使是現(xiàn)階段的聯(lián)合方案也僅能延長中、晚期患者2～4個月的生存期〔2〕。美國臨床腫瘤學(xué)會2016年將免疫治療作為最重要的癌癥治療，這將根本改進惡性實體腫瘤的治療策略〔2，3〕。不同的麻醉藥物對惡性腫瘤細(xì)胞的腫瘤微環(huán)境的影響逐漸被發(fā)現(xiàn)，并對腫瘤患者的后續(xù)治療及康復(fù)方案制定都有密切影響〔3〕。隨著進一步的研究，逐漸發(fā)現(xiàn)吸入性麻醉藥物對外周血細(xì)胞因子也有重要影響。七氟烷、異氟烷為臨床常用的吸入麻醉誘導(dǎo)藥物，丙泊酚則是最常見的靜脈麻醉藥物〔3〕。對于神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤切除手術(shù)來說，不僅需要長時間的穩(wěn)定、可靠的麻醉，還需要減少對于內(nèi)環(huán)境干擾及細(xì)胞免疫狀態(tài)損害，從而降低惡性腫瘤播散的可能性。研究發(fā)現(xiàn)，七氟烷在體外具有抑制肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的能力〔4～6〕。本研究擬探討吸入麻醉藥物對腦膠質(zhì)瘤患者外周血細(xì)胞因子表達的影響。

1 資料與方法

1.1臨床資料 本研究經(jīng)無錫第三人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，入選患者術(shù)前均簽署知情同意書。2015年1月至2018年8月神經(jīng)外科收治的美國麻醉醫(yī)師協(xié)會(ASA)Ⅰ～Ⅱ級且無心血管疾病的腫瘤確診患者36例，男22例，女14例；隨機分成七氟烷組(S組)，異氟烷組(I組)及全靜脈對照組(C組)各12例。排除標(biāo)準(zhǔn)：體重指數(shù)(BMI)>30 kg/m2；臨床上發(fā)現(xiàn)其他轉(zhuǎn)移；有內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)疾病史；有腫瘤放化療病史；激素及免疫抑制劑應(yīng)用史。各組一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組一般情況比較

1.2誘導(dǎo)麻醉方案 常規(guī)術(shù)前禁食、水10 h，無術(shù)前用藥。入室后常規(guī)開放靜脈通道，檢測動脈壓和心率，腦電雙頻指數(shù)等。S組在誘導(dǎo)前15 min，麻醉誘導(dǎo)劑丙泊酚模式輸注 1.5 μg/ml，咪達唑侖0.1 mg/kg。氣管插管后連接呼吸機機械通氣。I組基本同S組，誘導(dǎo)后吸入異氟烷維持麻醉，開啟異氟烷或七氟烷維持麻醉，呼氣末濃度維持1.5～2.0 MAC。氣流量為2 L/min，均靜脈輸注瑞芬太尼鎮(zhèn)靜。C組則僅使用丙泊酚，靶控濃度控制在3～4 μg/ml。術(shù)中根據(jù)引流量和尿量等計算液體損失量，以等量的乳酸鈉林格溶液進行補充。3組手術(shù)過程中生命體征及出入量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。手術(shù)由同一治療小組醫(yī)師進行，以盡量減少人為誤差。

1.3標(biāo)本收集 3組分別于手術(shù)結(jié)束即刻 (T1)經(jīng)頸內(nèi)靜脈抽取15 ml血樣，放入肝素鈉真空試管。同理在術(shù)后第3天 (T2)和第1周(T3)再次抽取外周血，離心分離血清，放入無菌試管根據(jù)要求儲存。

1.4CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)流式細(xì)胞檢測 首先2 000 r/min離心10 min后分離出血清，將抗凝后取全血標(biāo)本100 μl，分別加入PE標(biāo)記的CD4-異硫氰酸熒光素(FITC)、CD25-活化蛋白(AP)C各20 μl，室溫暗室孵育25 min。加入溶血素，振蕩混勻。固定細(xì)胞后，按照操作要求進行破膜，加入20 μl FoxP3-PE，混勻，按要求室溫暗室孵育。離心后棄上清液，經(jīng)過磷酸鹽緩沖液洗滌后進行混勻操作，下一步運用流式細(xì)胞儀進行復(fù)分析計數(shù)(FACS Calibur，美國BD公司)。數(shù)據(jù)分析獲得CD4+CD25+T 細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)檢測細(xì)胞因子 檢測白細(xì)胞介素(IL)-2和IL-10水平，按照試劑盒(購自美國BD公司)說明進行操作。

1.6實時熒光-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測 FoxP3 mRNA表達 收集外周血細(xì)胞按照 RT-PCR 試劑盒方法提取 RNA。 根據(jù)數(shù)據(jù)庫GenBank (NM-014009)中 FoxP3+的序列設(shè)計引物：上游：5′-GAACGCCATCCGCCACAACCTGA-3′，下游：5′-CCCTGCCCCCACCACCTCTGC-3′。循環(huán)條件根據(jù)要求進行。

1.7核因子(NF)-κB檢測 使用NF-κB通路專用芯片(購自Full moon公司)檢測下游NF-κB表達情況。按照廠商配置的操作手冊進行提取及標(biāo)記，后進行芯片雜交，雜交后干燥放置。使用GenePix Pro6.0軟件分析結(jié)果。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、秩和檢驗。

2 結(jié) 果

2.1外周血T細(xì)胞亞群的檢測 T2時S組外周血CD4+CD25+T細(xì)胞比例較I組和C組顯著減少(P<0.05)，而T1及T3時間點3組比較無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組各時間CD4+CD25+T檢測結(jié)果

與S組比較：1)P<0.05;表3、4同

2.2細(xì)胞因子的表達 3組各時間點IL-2表達未見明顯差異(P>0.05)；而S組IL-10在T2時顯著低于C組(P<0.05)，T1及T3無明顯差異(P>0.05)。見表3。

表3 3組各時間點血漿IL-2、IL-10 水平

2.3外周血FoxP3 mRNA表達 I組及S組外周血細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)FoxP3 mRNA 表達，S組表達較I組有明顯降低。C組外周血細(xì)胞未見FoxP3 mRNA 表達。見圖1。

圖1 3組各時間點外周血FoxP3 mRNA表達

2.4NF-κB表達檢測 T1、T3時3組NF-κB表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。T2時，C組和I組間NF-κB表達沒有明顯差異(P>0.05)，而S組NF-κB表達顯著高于C組、I組(P<0.05)。見表4。

表4 各組各時間NF-κB檢測結(jié)果

3 討 論

外界的各種刺激、應(yīng)激均是影響圍術(shù)期患者預(yù)后的重要因素，也與機體免疫狀態(tài)息息相關(guān)；腫瘤發(fā)生、發(fā)展意味著機體的免疫系統(tǒng)發(fā)生了重大變化。研究認(rèn)為，全身麻醉藥物可能對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生明顯影響，從而對腫瘤患者治療及預(yù)后產(chǎn)生重要影響〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)，麻醉方法或麻醉藥物對腫瘤患者內(nèi)環(huán)境一系列指標(biāo)均發(fā)生影響〔5〕，同時也有研究在胃癌等其他癌癥里發(fā)現(xiàn)麻醉方法或麻醉藥物對細(xì)胞因子的影響〔3〕。

靜脈血能夠真實地反映外周血細(xì)胞因子〔5，6〕。丙泊酚是廣泛運用于臨床的靜脈麻醉藥物，起效迅速，可應(yīng)用于誘導(dǎo)麻醉及不同深度維持〔7～9〕。七氟烷、異氟烷主要通過呼吸道及肺部代謝，無刺激性，臨床應(yīng)用廣泛。

抗腫瘤免疫反應(yīng)驅(qū)動了傳統(tǒng)治療聯(lián)合免疫治療策略的發(fā)展。Treg 是一類具有免疫抑制功能的細(xì)胞群，特征性表達轉(zhuǎn)錄因子FoxP3〔10〕。在胸腺內(nèi)Treg 細(xì)胞經(jīng)過發(fā)育成熟后特異性表達FoxP3+，具有免疫抑制功能〔11〕。Treg 細(xì)胞數(shù)量增加和其所占比例的增高，提示對機體免疫發(fā)揮抑制功能，導(dǎo)致對腫瘤生長的抑制能力降低，從而可能導(dǎo)致腫瘤進展。

本文發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞主要通過以下幾個方面發(fā)揮抑制作用：分泌IL-10 來抑制 CD4+T 細(xì)胞活化和增殖〔10，11〕；通過FoxP3-miR146-NF-κB 軸來實現(xiàn)調(diào)控〔12〕。本研究確認(rèn)了膠質(zhì)瘤患者體免疫抑制功能的CD4+CD25+T 細(xì)胞比例明顯增高，腫瘤患者外周血RT-PCR檢測顯示其高表達FoxP3。

腫瘤細(xì)胞的逃逸可能與免疫抑制相關(guān)的因子分泌和免疫抑制通路啟動有關(guān)〔13〕。研究提示，手術(shù)引起的免疫抑制狀態(tài)在術(shù)后幾小時內(nèi)至持續(xù)幾天不等〔13，14〕。術(shù)后打擊的免疫抑制會打破原先免疫系統(tǒng)和腫瘤細(xì)胞之間的平衡，從而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。對于麻醉，不僅需要減少術(shù)中的應(yīng)激，而且需要減少麻醉藥物可能造成的免疫抑制功能〔12，13〕。

本研究說明，現(xiàn)有的麻醉方案對于腫瘤的負(fù)荷，麻醉的應(yīng)激都沒有明顯加重，而七氟烷作為吸入麻醉藥物還有圍術(shù)期減輕免疫抑制的可能性。

NF-κB作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可因DNA損傷在內(nèi)的多種因子激活被上調(diào)，對細(xì)胞的代謝生存、細(xì)胞凋亡與腫瘤細(xì)胞的生長起著重要作用〔14〕。而通過檢測發(fā)現(xiàn)NF-κB升高與FoxP3表達降低相關(guān)，考慮可能與NF-κB-FoxP3的調(diào)節(jié)軸有關(guān)，目前在神經(jīng)腫瘤方面未見相關(guān)研究，還需進一步的研究。

綜上，七氟烷吸入麻醉可能比異氟烷更適合腦膠質(zhì)瘤患者的手術(shù)誘導(dǎo)。