基因芯片高通量檢測ALDH2基因多態(tài)性及生活習慣與胃癌易感性的相關因素

張磊 陳大明 馮福梅 吳嶺

(天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科，天津 301800)

胃癌病發(fā)機制與地域存在一定相關性。腫瘤疾病在早期分級中為1期的患者生存率明顯高于晚期患者，早期采取科學有效的治療方法可有效提高患者預后，改善生存率，但臨床中早期腫瘤無明顯癥狀，且容易誤診，因此臨床中多應用病理診斷〔1,2〕。遺傳基因與腫瘤因子存在正相關性，但對胃癌腫瘤的發(fā)病機制及食管癌等疾病的相關研究顯示，患者肝臟中的(ALDH)參與了酒精氧化代謝。發(fā)現(xiàn)ALDH2促進乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛，然后形成乙醛脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)闊o害醋酸〔3〕。乙醛屬于嚴重致癌物質(zhì)，是導致ALDH2失去活性轉(zhuǎn)為乙醛，引發(fā)癌癥的易感基因。本文采用DNA基因芯片高通量檢測ALDH2基因多態(tài)性與患者生活習慣及胃癌易感基因的相關性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2017年8月至2018年8月在天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科進行治療的胃癌患者161例，均按照WS316-2010胃癌診斷標準進行；其中男87例，女74例，年齡56～63歲，平均(60.12±2.20)歲。采集納入者2 ml靜脈血，并應用TIA血DNA試劑盒提取DNA基因。

1.2方法 ALDH2基因多態(tài)采用焦磷酸進行測序檢測，取15 μl PCR產(chǎn)物加入含有3 μl結(jié)合的抗生物素蛋白鏈球菌磁珠中和37 μl結(jié)合緩沖液〔含10 mmol/L Tris堿、2 mol/L NaCl、1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)與0.81 mmol/L Tween-20〕；置于96孔PCR板中進行震蕩孵育10 min(振速2 000 r/min)；將4個樣品板分別滴入180 ml高純度水，0.56×103g/L乙醇、變性緩沖液和120 ml洗滌緩沖液。將Vacuum Prep tool加入真空泵中，在高純度水中洗30 s后放置PCR板中吸取磁珠，然后依次在0.56×103g/L乙醇及變性緩沖液、120 ml洗滌緩沖液中清洗5、8、10 s后將Vacuum Prep tool加入孔中預熱25 μl 退火緩沖液和2 μl測序物的PSQ96板中，輕微摩擦后加熱2 min，溫度80℃后再次進行冷卻。在試劑盒中加入熒光物和酶混合物進行檢測。

1.3檢測指標 經(jīng)高通量測序?qū)LDH2基因多態(tài)性檢測其結(jié)果與生活習慣統(tǒng)計數(shù)據(jù)及胃癌易感性應用在早期診斷中的療效及兩者在臨床中的相關性。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS12.0軟件進行χ2檢驗、Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1ALDH2經(jīng)焦磷酸檢測結(jié)果 焦磷酸測序采用Taq Man PCR進行了隨機樣品驗證，結(jié)果顯示本研究與Taq Man PCR數(shù)據(jù)完全相同；本研究建立的測序方法安全可信，且靈敏度及特異度均達100%。ALDH2屬于不同基因型多態(tài)。A：ALDH2*1/1*GG野生型；B:ALDH2*1/*2GA為突變合子型；C：ALDH2*2/*2AA。結(jié)果是通過反測序法進行檢測，得到的檢測基因型為GG、GA、AA。見圖1。

圖1 ALDH2基因采用焦磷酸檢測方法測序

2.2入院前5年存在高發(fā)胃癌的危險因素 男性吸煙者顯著多于女性(P<0.05)，飲酒、熱食、速食、暴食生活習慣方面男女比例相差不多，喜好腌制與辛辣食物女性比例顯著多于男性(P<0.05)，見表1。

表1 入院前5年內(nèi)存在高發(fā)胃癌生活習慣比較〔n(%)〕

2.3ALDH2基因多態(tài)性遺傳平衡性檢驗結(jié)果 所有患者GG、GA、AA基因多態(tài)性比對差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.412，P=0.826)，男女患者對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 ALDH2基因多態(tài)性遺傳平衡性檢驗結(jié)果〔n(%)〕

2.4ALDH2基因多態(tài)性檢測結(jié)果和不良生活習慣評分對胃癌癥狀的多因素分析 基因型、等位基因的分布差異及不良生活習慣為胃癌癥狀的影響因素(P<0.05)，見表3。

3 討 論

臨床研究顯示，引發(fā)胃癌的相關因素中不良嗜好與地域性均是導致胃癌發(fā)病率的主要因素〔4，5〕。我國因日常生活習慣引發(fā)胃癌的地區(qū)有山東、內(nèi)蒙古及青海等，但因地域性引發(fā)胃癌的研究無確切的基因檢測方法證明不良日常生活是造成胃癌高發(fā)的主要原因〔6，7〕。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者中的ALDH2基因與肝臟中的酒精氧化代謝酶存在相同性。焦磷酸測序應用于基因檢測可快速獲得DNA每段序列數(shù)據(jù)，且檢測速度較快，此測序方法可直接進行高通量檢測〔8，9〕。

本研究表明，胃癌患者體內(nèi)確實存在ALDH2基因多態(tài)，且GG基因型分布較AA及GA多。等位基因分布中屬G等位基因較為明顯。本研究還顯示，熱食、暴食、吸煙、飲酒及喜好辛辣和腌制食物等是引發(fā)胃癌的主要危險因素。ALDH2位于染色體12q24.2，主要是促進肝臟代謝的一種酶，當ALDH2突變時，酒精被人體消耗促使體內(nèi)乙醛濃度升高，導致心跳加速和惡心等癥狀〔5，10〕。有研究表明，ALDH2基因在日本人群中的頻率為20.36%，中國為41.50%〔5〕。經(jīng)焦磷酸檢測胃癌患者DNA顯示ALDH2基因多態(tài)的分布與胃癌易感性和不良生活存在正相關性，且易感性可能因ALDH2和不良的生活習慣造成胃癌患者易感性差〔5，11，12〕。

綜上，ALDH2可有效作為胃癌檢測的主要標志物，且早期胃癌診斷應用ALDH2基因多態(tài)性可明顯觀察到患者胃癌易感性和不良生活導致的ADLH2突變。焦磷酸測序法可快速準確評估ALDH2的基因狀態(tài)，對胃癌患者的日常生活質(zhì)量提供了有效保障。