老年宮頸癌患者血清一氧化氮、半乳凝素-9表達及其與細胞凋亡的相關性

張冬麗 李艷云 孫桂霞 張紅霞

(河南大學淮河醫院婦產科，河南 開封 475000)

宮頸癌也稱為宮頸浸潤癌，是女性常見的一種惡性腫瘤，根據近年來流行學調查研究顯示，宮頸癌發病率近年來呈逐年上升趨勢〔1〕。一氧化氮(NO)是生物體內普遍存在的一種活潑的小分子物質，可參與信息傳遞、機體免疫應答、血管舒張調節、細胞凋亡等正常生理活動〔2，3〕。NO與多種病理過程相關，尤其與腫瘤血管生成及腫瘤細胞凋亡等有關〔4〕。半乳凝素(Gal)家族在動植物組織中有廣泛分布，可參與機體免疫調節、細胞增殖凋亡、細胞黏附及RNA轉錄加工等多種病理生理過程〔5〕。其中Gal-9在機體炎癥反應、腫瘤轉移、細胞生長分化等方面具有突出的影響〔6〕。本研究旨在探討老年宮頸癌患者血清NO、Gal-9表達及其與細胞凋亡的相關性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇2015年3月至2017年6月河南大學淮河醫院收治的76例老年宮頸癌患者，均經術后病理結果確診，年齡≥60歲；排除非宮頸原發腫瘤患者、合并其他惡性腫瘤患者。宮頸癌患者年齡60～82歲，平均(69.83±6.12)歲；低分化18例(23.68%)、中分化41例(53.95%)、高分化17例(22.37%)；按照國際婦產科聯盟(FIGO)病理分期標準：Ⅰ期16例(21.05%)、Ⅱ期25例(32.89%)、Ⅲ期27例(35.53%)、Ⅳ期8例(10.53%)；組織病理學分型：鱗癌58例(76.32%)、腺癌18例(23.68%)；淋巴結轉移34例(44.74%)、未轉移42例(55.26%)。

再選擇同期收治的老年子宮頸上皮不典型增生(CIN)患者50例及老年健康人群50例作為對照。CIN組中年齡60～80歲，平均(68.79±6.38)歲，其中CIN Ⅱ期28例(56.00%)、CIN Ⅲ期22例(44.00%)。健康對照組年齡60～83歲，平均(69.57±7.21)歲。三組受試者年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2流式細胞技術測定細胞凋亡指數(AI) 分別取宮頸癌組織、CIN組織及正常宮頸組織，置于盛有磷酸鹽緩沖液(PBS)的小燒杯內，使用眼科剪將其反復剪碎后過濾(160目尼龍網篩)，制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×109/L。取1 ml單細胞懸液，離心后棄去上清，加入1 ml PBS，重復離心后棄去上清。使用預冷的70%乙醇固定細胞，然后置于4℃冰箱內過夜。次日離心5 min，棄去上清后使用PBS漂洗一次，加入Pnase合成期(PNase)酶37℃作用半小時，加入50 μg/ml碘化丙啶(PI)1 ml，4℃避光染色20 min，過濾，使用羧基麥芽糖鐵(FCM)測定。以正常人外周血淋巴細胞作為正常二倍體標準，使用CELLQUEST分析軟件計算各組細胞AI。

1.3血清NO、Gal-9水平檢測 采集三組受試者清晨空腹靜脈血5 ml，肝素抗凝，離心分離血清，-40℃保存待測。采用硝酸還原酶法檢測受試者血清NO水平，NO檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；采用雙單抗夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測受試者血清Gal-9水平，Gal-9 ELISA檢測試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。操作嚴格按照試劑盒使用說明書進行。

1.4統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、方差分析、χ2檢驗、秩和檢驗和Spearman相關分析。

2 結 果

2.1三組細胞凋亡指數比較 三組受試者AI比較差異具有統計學意義(F=28.719，P<0.05)，其中宮頸癌組AI指數(6.31±5.60)顯著高于健康對照組(2.38±0.73，P<0.05)，但明顯低于CIN組(9.33±2.46，P<0.05)。

2.2三組血清NO、Gal-9表達比較 三組血清NO、Gal-9水平比較差異具有統計學意義(P<0.05)，且宮頸癌組血清NO、Gal-9水平顯著高于健康對照組與CIN組(P<0.05)，見表1。

表1 三組血清NO、Gal-9水平比較

與健康對照組比較：1)P<0.05；與CIN組比較：2)P<0.05

2.3宮頸癌患者血清NO、Gal-9水平與細胞凋亡相關性分析 宮頸癌患者血清NO、Gal-9水平與AI呈顯著正相關(r=0.813、0.872，P<0.05)。

2.4血清NO、Gal-9水平與老年宮頸癌患者臨床病理特征關系 宮頸癌臨床分期Ⅲ、Ⅳ期患者血清NO、Gal-9水平顯著高于Ⅰ、Ⅱ期患者(P<0.05)，腫瘤低分化患者血清Gal-9水平顯著高于中、高分化患者(P<0.05)，其余臨床病理特征對血清NO、Gal-9水平無明顯影響(P>0.05)，見表2。

表2 血清NO、Gal-9水平與老年宮頸癌患者臨床病理特征關系

3 討 論

細胞凋亡是一種與有絲分裂相反的方式調節細胞群體相對穩定的重要方式，在細胞發育、增殖、分化及死亡過程中均有重要的影響，同時，細胞凋亡對于腫瘤的發生、抗腫瘤藥物的治療及細胞間信息傳遞等方面同樣有著重要的作用〔7～9〕。本研究表明當宮頸上皮細胞發生不典型增生時，細胞凋亡增加，此時仍能維持細胞增殖與死亡之間的平衡；而宮頸癌患者細胞凋亡較CIN患者明顯降低，表明隨著病變加重至癌變階段，細胞凋亡率減少，提示宮頸癌的發生發展與細胞凋亡之間有著密切的相關性，隨著疾病的進展及細胞內相關基因表達的變化，細胞凋亡受到抑制，導致宮頸上皮細胞平衡被破壞，從而引發癌變〔10，11〕。

NO是一種非常活潑的自由基，可對機體血管、神經系統等發揮重要的調節作用，但NO濃度較高時具有一定的細胞毒性，在腫瘤的發生發展中發揮一定的作用〔12〕。近年來學者報道顯示，誘導型一氧化氮合酶(iNOS)在子宮頸癌、卵巢癌等多種婦科腫瘤組織中均有明顯表達上調趨勢，提示腫瘤組織局部NO生成增多〔13,14〕。Gal-9在細胞質、細胞外基質及細胞核內均有分布，研究表明，Gal-9在胃腸道、肝臟及各種免疫細胞中均有高表達，同時在胃癌、結直腸癌、乳腺癌、前列腺癌等不同腫瘤組織中也檢測到了Gal-9表達〔15,16〕。本研究結果提示宮頸上皮細胞不典型增生至癌變過程中，NO及Gal-9發揮著一定的作用，與相關研究報道結果相似〔17〕。

關于NO對細胞凋亡的影響，研究顯示，NO可誘導肌母細胞、視網膜神經細胞及巨噬細胞發生凋亡，但是其對肝細胞、B淋巴細胞凋亡起著抑制作用〔18〕。而報道顯示，Gal-9可誘導胸腺細胞、T細胞及巨噬細胞的凋亡，同時對腫瘤細胞凋亡、轉移等發揮了一定作用〔19，20〕。本研究結果提示NO、Gal-9參與到了宮頸癌細胞凋亡過程中，且隨著患者腫瘤臨床分期的增加，NO、Gal-9水平顯著升高，表明在機體對抗腫瘤發生發展過程中，可能受到NO、Gal-9等多種因素的影響，導致細胞凋亡與增殖的平衡被打破。

綜上，血清NO、Gal-9參與到了老年宮頸癌發生發展過程中，同時對宮頸癌組織細胞凋亡發揮一定的影響作用，其具體影響機制，還需深入研究。