CD90在肝內膽管細胞癌中的表達及其與患者預后不良的關系

朱 彤， 饒井芬， 劉承一， 肇 爽， 張 力

1 承德醫學院附屬醫院 腫瘤科， 河北 承德 067000； 2承德醫學院， 河北 承德 067000

肝內膽管細胞癌是一種源于肝內膽管上皮細胞的原發性腺癌，在原發性肝癌中發病率僅次于肝細胞癌位居第2位，且近年來其發病率有所上升[1]。目前對于肝內膽管細胞癌主要以手術切除為首選治療方式，但是由于患者早期診斷困難、手術切除率低以及術后容易轉移復發等因素，患者預后情況并無明顯提高[2-3]。因此，研究肝內膽管細胞癌的發生以及促進腫瘤轉移復發關鍵因子，對于腫瘤的治療以及預后改善具有著重要意義[3]。CD90是錨定于糖基磷脂酰肌醇的一種糖蛋白，在成纖維細胞、胸腺細胞、內皮細胞以及神經系統等多種細胞中均有所表達，目前研究[4-5]顯示，CD90是肝細胞癌重要的一種抗原標志物，在肝細胞癌發病和轉移中發揮著重要作用，而其在肝內膽管細胞癌中的表達情況及與患者預后相關性目前尚無相關報道。本研究旨在探討CD90在肝內膽管細胞癌中的表達及與淋巴結轉移和預后不良的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2013年3月-2016年3月承德醫學院附屬醫院手術切除的肝內膽管細胞癌患者組織標本及其癌旁組織標本。另收集同期肝臟外傷手術中所取正常肝組織標本作為對照。肝內膽管細胞癌患者均行根治性切除術，且手術由同一組醫師完成，均經術后病理檢查證實為肝內膽管細胞癌。患者術前未行放療、化療等相關治療；癌旁組織取自距離腫瘤組織邊緣2 cm以外的區域。術中切取新鮮組織，分類收集并標記基本信息后迅速轉移至液氮罐中暫存，最后轉移至承德醫學院附屬醫院標本庫保存(-80 ℃)。排除合并嚴重心、腦、腎等系統疾病以及合并其他系統腫瘤患者。標本均在患者或家屬知情同意情況下獲取。本研究方案經由承德醫學院附屬醫院委員會審批(批號：20121208)。

1.2 免疫組化檢測及結果判讀 將石蠟標本連續切片后置于恒溫烘箱內烤片，脫蠟后進行乙醇脫水以及高壓抗原修復；加入3%過氧化氫溶液以及稀釋后的CD90鼠抗人單克隆抗體(北京博奧森科技有限公司)，置于4 ℃條件下孵育過夜；加入第二抗體以及DAB顯色。采用顯微鏡觀察，使用自來水沖洗終止染色。蘇木素復染3 min后使用自來水清洗；使用濃度1%的鹽酸乙醇適度分化，溫水返藍；最后將切片晾干后封片。

結果判斷：將切片置于400倍顯微鏡下，任選5個視野進行觀察。參照文獻[6]結果判斷標準，細胞質染色呈深黃色或黃色作為CD90陽性細胞，計算陽性細胞百分比并進行評分：0分(陽性細胞0)、1分(陽性細胞≤25%)、2分(26%<陽性細胞≤50%)、3分(50%<陽性細胞≤75%)、4分(陽性細胞>75%)；然后根據陽性細胞染色強度進行評分：0分(無顯色)、1分(淺棕黃色)、2分(棕黃色)、3分(棕褐色)。將陽性細胞百分比評分與染色強度評分相加，評分0分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)、4～5分為中度陽性(++)、6～7分為強陽性(+++)。

1.3 術后隨訪 術后對患者進行隨訪，隨訪截止日期為2019年7月31日，分別以術后局部/遠期復發以及死亡作為終點事件，分析患者術后無復發生存情況及總體生存情況。

2 結果

2.1 一般資料 共納入49例肝內膽管細胞癌患者，其中男39例，女10例，年齡33～78歲，平均(53.27±12.95)歲；對照組40例，其中男31例，女9例，年齡25～74歲，平均(52.93±10.94)歲。2組患者性別、年齡差異均無統計學意義(P值均>0.05)。

2.2 3組CD90蛋白表達情況比較 肝內膽管細胞癌組織CD90中強度陽性表達率為65.31%，癌旁正常組織CD90中強度陽性表達率為30.61%，正常肝組織CD90中強度陽性表達率為0。肝內膽管細胞癌組織中CD90蛋白中強度陽性表達率顯著高于癌旁正常組織與正常肝臟組織(P值均<0.05)(表1)。

表1 3組CD90蛋白表達情況比較[例(%)]

注：與肝內膽管細胞癌組織比較，1)P<0.05；與癌旁正常組織比較，2)P<0.05。

2.3 CD90蛋白表達與肝內膽管細胞癌患者臨床指標的關系 CD90蛋白表達與肝內膽管細胞癌患者TNM分期及肝門淋巴結轉移有關(P值均<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤數目、腫瘤分化情況無關(P值均>0.05)(表2)。

2.4 CD90蛋白表達與肝內膽管細胞癌患者預后的關系 CD90蛋白陰性/弱陽性表達患者術后無復發生存率及總體生存率均明顯優于中/強陽性表達患者(χ2值分別為3.845、4.152，P值分別為0.025、0.021)(圖1、2)。

3 討論

肝內膽管細胞癌為原發性肝癌的一種，是繼肝細胞癌的第二常見肝內惡性腫瘤，以淋巴結轉移為特征，其腫瘤侵襲以及轉移的惡性程度較肝細胞癌更高[6]。近些年來，肝內膽管細胞癌發病率明顯上升，由于患者發病較為隱匿，臨床表現缺乏特異性，患者早期診斷較為困難且術后復發率高，大部分患者在臨床診斷時已經處于疾病晚期，手術治療效果不佳甚至無手術指征，患者臨床預后極差，已成為肝內原發性惡性腫瘤死亡的主要原因，因此對于肝內膽管細胞癌病理發展機制的研究有著重要的臨床意義[7-9]。

CD90是免疫球蛋白超家族中的一員，其主要通過甘油二酯錨定于糖基磷脂酰肌醇的羧基端而附著于細胞膜上[10]。在血液干細胞中發現CD90蛋白的表達，經過6 d細胞因子的處理，CD90+細胞群進入細胞周期，而CD90-細胞群仍處于細胞靜止期，提示CD90陽性表達可促進細胞增殖[11]。此外，有研究[12]顯示，CD44+CD90+細胞亞群在小細胞肺癌中的成球能力更強，且具有上皮-間充質轉化特征。而從胚胎干細胞中分選出來的CD90+細胞群增殖能力明顯強于CD90-細胞群，且CD90隨著胚胎干細胞的成熟表達逐漸降低[13-14]。而在前列腺癌組織標本中，同樣發現CD90表達較正常前列腺組織高，且其在血管周圍的表達水平更高，提示在腫瘤的生長以及血管形成過程中，CD90均發揮著重要作用[15]。

表2 CD90蛋白表達與肝內膽管細胞癌患者臨床指標關系分析[例(%)]

圖1肝內膽管細胞癌患者術后無瘤生存情況分析

本研究結果顯示，肝內膽管細胞癌組織CD90中強度陽性表達率為65.31%，癌旁正常組織CD90中強度陽性表達率為30.61%，正常肝組織CD90中強度陽性表達率為0，肝內膽管細胞癌組織中CD90蛋白中強度陽性表達率顯著高于癌旁正常組織與正常肝組織(P<0.05)。提示在肝內膽管細胞癌發生發展過程中，CD90蛋白表達發揮著重要的影響，可能促進了腫瘤細胞的增殖。此外，本研究進一步分析了CD90表達與患者臨床病理特征的關系，結果顯示，CD90蛋白表達與肝內膽管細胞癌患者TNM分期及肝門淋巴結轉移有關(P值均<0.05)。提示CD90蛋白與肝內膽管細胞癌患者疾病進展密切相關，同時CD90可能促進腫瘤細胞的血行轉移，與相關研究[16-17]報道結果相似。Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示，CD90蛋白陰性/弱陽性表達患者術后無復發生存率及總體生存率均顯著優于中/強陽性表達患者(P值均<0.05)，提示CD90表達與術后復發及生存情況密切相關，CD90蛋白高表達可促進腫瘤的術后復發，影響患者生存預后，可能與CD90促進腫瘤血行轉移等因素有關[18-19]。有學者[20-21]從肝癌細胞株、肝癌患者組織以及血液中分選出CD90+細胞群，結果顯示，與CD90-細胞群比較，CD90+細胞群具有更強的成瘤能力，且能夠無限增殖，因此認為CD90+細胞群可能是“肝癌干細胞”。本研究也進一步證實了在肝內膽管細胞癌中，CD90對腫瘤的發生可能同樣發揮了重要的作用。但是由于本研究納入樣本量有限，且腫瘤作為一種多因素影響的共同結果，CD90可能只是其中因素之一，還需要進一步深入研究分析。

綜上所述，CD90在人肝內膽管細胞癌組織內高表達，且與患者肝門淋巴結轉移及不良預后有關，在腫瘤發生發展及轉移過程中產生了重要的影響。