不同水深地雷爆炸對脊髓損傷特點及機制研究

張成生，張志龍，馬 驍，王 鵬，劉 成，韓庚奮

淺灘登陸作戰遭遇地雷爆炸時因水下沖擊波會造成嚴重損傷，水下沖擊波的傳播特點是峰值超壓較高、正壓持續時間較短[1]。水下沖擊波強度遠遠高于空氣中，且傳播速度快、能量損耗少，致死范圍較大[2]。同質量同距離的地面爆炸與水下爆炸相比，峰值壓力可相差200倍左右[3]。淺灘地雷爆炸的損傷特點和機制可能與陸地不同；沖擊波傳導的機制及強度可能因水深的不同而不同。既往研究表明，淺灘區觸雷爆炸肢體局部軟組織損傷較陸地輕，但是骨骼損傷較陸地觸雷爆炸明顯嚴重[4]。水下地雷爆炸的沖擊波除引起局部損傷，還會引起遠處臟器或組織的損傷，由于沖擊波在氣體-液體界面產生剪力波，導致附近組織及臟器嚴重損傷，由于椎管和脊髓密度差別較大，可因剪力波及瞬間加速度而損傷脊髓。因此，研究淺灘區肢體觸雷爆炸造成的脊髓損傷特點及機制，為兩棲登陸作戰觸雷爆炸傷的救治和防護提供依據十分必要。

1 材料和方法

1.1實驗動物分組 新西蘭大白兔64只，由中國人民解放軍陸軍軍醫大學附屬大坪醫院野戰外科研究所實驗動物中心提供。實驗動物使用批準證書：SYXK(渝2017-0005)。使用品紅溶液于兔耳內外側直接標號進行編號，隨機分為對照組、陸地組、淺水組、深水組，每組16只。淺水組水深至新西蘭大白兔膝關節；深水組水深至新西蘭大白兔第3腰椎(L3)。

1.2動物致傷及標本取材

1.2.1動物致傷：所有新西蘭大白兔通過耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉30 mg/kg進行麻醉，麻醉平穩后將其固定于塔形金屬支架，支架與水平面成約75°角，將新西蘭大白兔俯臥位置于支架一側，使其成半直立狀態，右后肢著地，左后肢呈屈曲狀態。將600 mg 三硝基甲苯(TNT)防水處理后，置于新西蘭大白兔右后肢，然后電引爆。致傷后立刻給予止血、包扎。觀察時間為12 h。

1.2.2標本取材：傷后3、6、12 h分別抽4組大白兔取動脈血3 ml，血液在1500 g離心力下離心10 min，提取上清，超低溫冰箱保存。傷后12 h沿新西蘭大白兔腰背部切一縱形切口，分離肌肉，咬骨鉗咬除棘突及兩側椎弓根，充分暴露椎管，取L3～4脊髓，部分用于Western Blot 檢測，置于凍存管，立刻放于液氮罐中保存；部分使用4%多聚甲醛固定，用于病理學檢查。

1.3病理切片制作及染色步驟 將固定好的標本用蒸餾水稍洗后，脫水，透明，石蠟包埋，切片機切為厚度4 μm。蘇木精染色3 min， 0.6%鹽酸乙醇分化30 s，1%醇溶性伊紅染色2 min，之后使用濃度為80%、95%、100%乙醇各浸泡2次，每次浸泡2 min。使用二甲苯透明，中型樹膠封片。

1.4脊髓膠質纖維酸性蛋白(glial fibrilary acidic protein， GFAP)蛋白含量 采用Western Blot進行檢測：將脊髓樣品放在研缽中研磨后分裝在離心管中。將酶蛋白抑制劑混合物與組織蛋白抽提試劑按照1∶99混合，每個樣品中加入250 μl，在沸水中煮10 min，1200 r/min，4℃離心5 min。取上清，分裝于0.5 ml的離心管中，將玻璃板先后用洗滌劑、無水乙醇清洗，待干燥后固定于垂直電泳槽上，用0.8%瓊脂糖密封玻璃板邊緣；配制分離膠，灌膠。加入足夠的電泳液后，上樣，每泳道加入50 μg的總蛋白。電泳完畢后，剝膠，留取具有目的蛋白的分離膠，用于轉膜，轉膜條件為250 mA，2 h。之后使用脫脂奶粉封閉，37℃搖床上搖動封閉1 h；PVDF膜漂洗后，一張加入多克隆山羊抗兔GFAP抗體溶液(稀釋濃度為1∶1000)；另一張加入GAPDH抗體溶液(稀釋濃度為1∶2000)，4℃冰箱中孵育過夜。棄去一抗溶液，分別浸入辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠抗體(稀釋濃度1∶10 000)溶液中，在37℃恒溫振蕩器中孵育2 h。之后，棄去抗體溶液，使用PBST溶液脫色搖床洗膜5次，每次5 min。顯色后使用Quantity one 4.6.2軟件進行蛋白條帶灰度分析。

1.5中樞神經損傷標志物檢測 采用蛋白免疫吸附試驗(ELISA)檢測神經元特異性烯醇酶(neuron-specific enolase， NSE)和髓磷脂堿性蛋白質類(myelin basic protein， MBP)：配制標準品液，在酶標包被板上加入稀釋好的標準品或兔動脈血清100 μl，將反應板充分混勻后置于37℃溫育20 min；洗滌；每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50 μl，空白孔除外。將反應板充分混勻后置于37℃溫育40 min；棄去液體，洗滌；每孔加酶標抗體工作液100 μl，將反應板置于37℃ 15 min。棄去液體，甩干，洗滌。每孔加入底物工作液100 μl，置于37℃暗處顯色15 min。取出酶標板，每孔加入100 μl終止液，充分混合均勻；在450 nm波長下測量每個孔的吸光度值。同法檢測MBP。

1.6生物力學測試 取陸地組、淺水組、深水組新西蘭大白兔共48只，將壓力傳感器布放于其的L3椎管內，加速度傳感器固定于L3橫突。測試L3椎管內沖擊波壓力峰值和加速度峰值。使用TST6150采集儀采集信號，DAP6.01軟件分析。

2 結果

2.1兔脊髓損傷大體形態變化 地雷爆炸后陸地組脊髓未發現異常，見圖1A。淺水組蛛網膜下腔出血發生率為43.75%(7/16)，見圖1B。神經根周圍點狀出血發生率為12.50%(2/16)，見圖1C。深水組脊髓挫傷發生率為37.50%(6/16)，損傷均發生在水平面附近的脊髓，見圖1D；神經根周圍點狀出血發生率為62.50%(10/16)，蛛網膜下腔出血發生率為25.00%(4/16)，見圖1E。

圖1 各致傷組新西蘭大白兔脊髓損傷的大體形態觀察

A.陸地組脊髓無異常；B.淺水組蛛網膜下腔出血；C.淺水組神經根周圍的點狀出血；D.深水組脊髓胸段的挫傷；E.深水組蛛網膜下腔出血

2.2兔脊髓病理形態變化 對照組脊髓未見異常；陸地組脊髓神經元細胞水腫變性，核仁不清；淺水組可見神經元細胞水腫變性、及紅細胞滲出；深水組可見神經元細胞水腫變性及大量紅細胞滲出。見圖2。

圖2 各組新西蘭大白兔脊髓病理變化(HE×400)

A.對照組；B.陸地組；C.淺水組；D.深水組

2.3兔脊髓及腦皮質GFAP蛋白含量比較 淺水組、深水組脊髓及腦皮質GFAP蛋白表達水平高于對照組及陸地組(P<0.05)；淺水組與深水組、陸地組與假致傷組間兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖3和表1。

圖3 各組新西蘭大白兔脊髓及腦皮質GFAP蛋白含量

GFAP為膠質纖維酸性蛋白，GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶

2.5高速攝像下爆破情景 陸地組起爆后1 ms可見巨大的火球向四周擴散。淺水組并未形成起泡，而是在起爆后2 ms爆炸氣體直接沖出水平面，形成水柱。深水組起爆后3 ms形成一氣泡，氣泡快速擴大，并產生沖擊波損傷肢體，氣泡快速上升，56 ms后沖出水面。見圖4。

表1 4組新西蘭大白兔致傷后兔脊髓GFAP蛋白印跡灰度變化

注：GFAP為膠質纖維酸性蛋白，GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶；與對照組比較，aP<0.05；與陸地組比較，cP<0.05

2.4中樞神經損傷標記物表達水平比較

2.4.1NSE水平比較： 4組傷前及對照組傷前和傷后3、6、12 h的NSE水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)，陸地組、淺水組、深水組傷后3、6、12 h的NSE水平均高于傷前(P<0.05)。傷后3 h淺水組和深水組NSE水平高于對照組和陸地組(P<0.05)。陸地組和對照組NSE水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。傷后6、12 h陸地組、淺水組、深水組NSE水平均高于對照組，且深水組高于淺水組和陸地組，淺水組高于陸地組(P<0.05)。見表2。

表2 4組新西蘭大白兔動脈血清NSE表達水平

注：NSE為神經元特異性烯醇化酶；與傷前比較，aP<0.05；與對照組比較，cP<0.05；與陸地組比較，eP<0.05；與淺水組比較，gP<0.05

2.4.2MBP水平比較：4組傷前MBP水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。對照組傷前和傷后3、6、12 h的MBP水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。陸地組、淺水組、深水組傷后3、6、12 h的MBP水平均高于傷前(P<0.05)。陸地組、淺水組、深水組傷后3、6、12 h的MBP水平均高于對照組，且深水組高于淺水組和陸地組(P<0.05)。淺水組和陸地組傷后3、6、12 h 的MBP 水平比較無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 4組新西蘭大白兔動脈血清 MPB表達水平比較

注：MBP為髓鞘堿性蛋白；與傷前比較，aP<0.05；與對照組比較；cP<0.05；與陸地組比較，eP<0.05；與淺水組比較，gP<0.05

圖4 高速攝像下爆破情景

A.陸地組起爆后1 ms；B.淺水組起爆后2 ms；C.深水組起爆后20 ms

2.6生物力學檢測比較 深水組椎管內壓力峰值均高于淺水組及陸地組(P<0.05)，淺水組椎管內壓力峰值與陸地組比較無統計學意義(P>0.05)。深水組的椎體加速度峰值均高于淺水組及陸地組，且淺水組椎體加速度高于陸地組(P<0.05)。見表4。

表4 3組新西蘭大白兔生物力學測試結果比較

注：與陸地組比較，aP<0.05，與淺水組比較，cP<0.05

3 討論

爆炸傷多由于臟器傷情嚴重而掩蓋了脊髓損傷的表現。脊髓爆震傷是爆炸后脊髓損傷的主要類型,其損傷從細胞水平觀察主要表現為細胞凋亡[5]。爆炸沖擊波可導致脊髓硬膜外出血，如不能早期發現快速治療，易發生較高的致殘率和病死率[6]。如果能早期判斷傷情特點，及時分類后送，在盡可能短的時間內積極治療，對于傷員后期的功能恢復具有重要的意義。

本研究結果顯示，淺水組蛛網膜下腔出血發生率高于深水組；深水組出現脊髓的挫傷，且挫傷多發生與氣-液平面，但淺水組卻未見此種損傷特點。陸地組肉眼觀察未見異常，這證明淺水組和深水組脊髓損傷較陸地嚴重，且淺水組和深水組的損傷特點不同。深水組地雷爆炸，由于水的密度較大且不可壓縮，沖擊波損耗較小，強度較大，較陸地有更嚴重的破壞效應，所以損傷較淺水組及陸地組嚴重。生物力學測試結果表明，深水組椎管內壓力峰值和加速度峰值均高于淺水組及陸地組，與上述傷情相一致。深水組出現脊髓的挫傷，且挫傷多發生在氣-液平面，但淺水組卻未發現。筆者認為主要原因是水與空氣密度不同，在交界面發生剪力所致損傷。淺水組脊髓損傷主要表現為蛛網膜下腔出血及神經根周圍的點狀出血。二者損傷特點不同，與爆炸損傷的機制不同相關，高速攝像提示深水組起爆后3 ms形成氣泡，氣泡快速擴大，并快速上升，56 ms后沖出水面；而淺水組并未形成起泡，而是在起爆后2 ms爆炸氣體直接沖出水平面，形成水柱，這充分說明不同水深的爆炸損傷機制不同。 此外，生物力學測試表明，淺水組椎管內壓力峰值與陸地組無明顯差別，而加速度峰值明顯高于陸地組，說明淺水爆炸的脊髓損傷主要因瞬間加速度所致，這可能與水柱的產生有關。

沖擊波可損傷脊髓內血管而造成脊髓出血、缺血性損傷，脊髓損傷主要是白質結構的異常、水腫及脫髓鞘改變，以及神經元細胞核濃聚、偏位甚至破裂[7]。高壓空氣沖擊波在脊髓實質內產生拉伸、壓縮和剪切力，從而導致廣泛的軸索損傷，主要表現出三種不同的病理形式:微管斷裂、神經絲致密化和鈣蛋白酶介導的血影蛋白破壞[8]。郭大興等[9]研究表明沖擊波超壓峰值為3 MPa時脊髓病理可見大量散在的出血壞死灶，可造成大鼠雙后肢運動誘發電位潛伏期延長或波幅下降。本研究中光鏡下觀察陸地組脊髓神經元細胞僅見水腫變性，核仁不清。淺水組可見前角運動神經元細胞水腫變性，及紅細胞滲出。深水組可見脊髓前角大量紅細胞滲出。病理學檢查證明淺水區地雷爆炸后脊髓的嚴重損傷。脊髓損傷由于軸突和神經細胞的變性、凋亡，而失去感覺、運動和自主功能。脊髓受沖擊傷后自由基產生增多，如脊髓內丙二醛，白介素-1β(IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α等，這些物質使脊髓細胞壞死凋亡進一步發展[10]，誘導一系列生化反應引起脫髓鞘改變。軸突的變性和周圍的免疫反應被稱之為“二次損傷”。脊髓的二次損傷會進一步影響突觸重塑及神經環路再生,成為脊髓損傷修復的主要障礙之一[11]，如及時治療可能會減輕“二次損傷”。脊髓損傷后常使用甲基強的松龍抑制炎癥反應，以減少對脊髓的二次損害[12]。靜脈注射甲強龍能夠有效緩解脊髓損傷急性神經痛，阻止急性神經痛轉變為難治性慢性神經痛，能夠顯著改善患者的生活質量[13]。因此，在后送和治療中必須給予高度關注，力爭做到早診斷，早治療。

本研究結果顯示，致傷后淺水組及深水組GFAP、NSE、MBP表達水平較陸地組明顯增高，與顯微組織形態觀察結果相一致。證明不同水深的地雷爆炸脊髓損傷均較陸地地雷爆炸嚴重。中樞神經系統神經元細胞的損傷可能會導致一些蛋白滲漏，如果有血腦屏障被破壞，這些蛋白會進入外周血液。在創傷性中樞神經損傷患者的血清中，這些蛋白的濃度通常會增高。急性脊髓損傷患者的血清NSE 蛋白水平均顯著高于未伴脊髓損傷及正常人群，且其血清水平 24 h 達到峰值，隨后逐漸降低[14]。血清 NSE>6.26 ng/ml 時提示可能出現了脊髓損傷[15]。血清 NSE 結合 CT 檢查可預測急性脊髓損傷的嚴重程度[16]。

GFAP主要表達在纖維性星形膠質細胞和反應性星形膠質細胞，對神經元的存活和膠質細胞的增生有促進作用，其表達水平的高低可反映星形膠質細胞增殖、壞死等改變的程度，是早期診斷中樞神經損傷的可靠指標[17]。本研究結果顯示，兔脊髓GFAP、NSE和MBP蛋白含量，損傷最為嚴重的是深水組，其次是淺水組，陸地組損傷不明顯。這說明水越深，爆炸對脊髓的損傷越嚴重。脊髓損傷后，一方面星形膠質細胞表達GFAP，自我復制有利于損傷修復和功能恢復；另一方面，因過度膠質化形成的膠質瘢痕影響了神經結構修復和神經功能恢復。由于受損的神經元的軸突末梢GFAP含量增加， GFAP的合成可促進形成膠質瘢痕。脊髓損傷后損傷脊髓組織中 GFAP 的表達增加，損傷后14 d 達到最高[18]。早期減少GFAP的合成可阻止膠質瘢痕的形成。有學者通過下調GFAP的表達水平從而達到臨床治療的目的。Toyooka等[19]將siRNAs 導入GFAP抑制膠質活性發現可以改善急性排尿功能障礙，證明下調GFAP等蛋白活性，抑制星形膠質細胞的過度增殖，可以有效的治療脊髓損傷。王芳等[20]研究結果表明，干細胞通過促進兔損毀側交感神經節內微管相關蛋白-2的表達,同時抑制GFAP的表達來發揮神經功能的修復作用。薛成蓮等[21]通過給予急性腦梗死患者采取阿替普酶靜脈溶栓及銀杏葉提取物注射液治療，結果表明可下調血清GFAP水平，提高疾病整體治療效果。GFAP與腦損傷嚴重程度和死亡相關，通過檢測GFAP可預測腦損傷程度及病死率。本研究中淺水區地雷爆炸傷對脊髓的損傷較陸地嚴重，傷后GFAP表達增強，通過對GFAP的檢測可為臨床診斷和治療提供指導。

綜上所述，不同水深的地雷爆炸會導致嚴重的脊髓損傷，包括蛛網膜下腔出血、神經根周圍出血及脊髓的挫傷等表現；且不同水深的地雷爆炸損傷機制不同，傷情特點也不同。脊髓損傷的治療十分復雜，因此在后送和入院治療時要考慮到脊髓損傷的特點，要盡早進行檢查和治療，確保功能的恢復。