miR-374b-5p靶向調控ING1表達及對乳腺癌細胞增殖、侵襲和轉移的影響

李 霞，任玉嫄，林 潔，周 琦

乳腺癌是常見的惡性腫瘤之一，是全球女性腫瘤相關死亡的主要原因。流行病學數據顯示，2018年全世界有210萬左右新診斷乳腺癌病例，約占女性腫瘤病例的25%；在我國乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤[1-2]。近年來，乳腺癌診斷和治療取得了重大進展，但患者的預后仍很差[3]。乳腺癌患者死亡的主要原因是腫瘤的惡性增殖和轉移[4-5]，因此，研究乳腺癌的潛在機制、開發用于治療乳腺癌的新型治療靶標對改善患者預后具有重要意義。

微小RNAs(microRNAs, miRNAs)幾乎在所有類型的腫瘤中均具有關鍵作用，miRNAs是一組長度為21～23個核苷酸的內源性非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中，參與了細胞增殖、分化和凋亡等重要過程；其可作為致癌基因和抑癌基因在腫瘤發生發展中起著重要作用，被認為是潛在的腫瘤診斷標志物和腫瘤治療靶點[6-7]。在乳腺癌中已經鑒定了許多異常表達的miRNAs，是乳腺癌惡性生物學行為的關鍵調控者。miR-374b-5p在多種腫瘤中表達異常[8-10]，Chang等[11]報道，miR-374b-5p在乳腺癌患者全血中表達增加。miR-374b-5p參與乳腺癌的發病機制尚不清楚，因此本研究采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測了miR-374b-5p在乳腺癌組織和細胞中的表達，并通過體外抑制乳腺癌細胞中miR-374b-5p的表達后，觀察細胞增殖、侵襲和凋亡的變化，探討miR-374b-5p參與乳腺癌發病的可能機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1一般資料 選擇2015年12月—2017年12月我院行手術治療的乳腺癌患者，患者術前均未接受化療、放療、靶向和內分泌等任何形式的治療；組織經病理專家證實為乳腺癌。共收集50例乳腺癌標本。所有操作均符合我院倫理委員會制定的相關規定，本研究已獲得委員會的批準。

1.2試劑與儀器 TRIzol、PrimeScriptTM RT reagent Kit反轉錄和SYBR Premix Ex TaqTM qRT-PCR試劑盒等均購自日本TaKaRa公司；miR-374b-5p、U6、生長抑制因子1(inhibitor of growth 1, ING1)和GAPDH引物均由上海捷瑞生物有限公司設計合成；乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231、HCC1937和正常乳腺細胞系MCF 10A均購自美國ATCC細胞庫；RPMI-1640、L-15、DMEM-F12培養基及胎牛血清FBS均購自美國Gibco公司；miR-374b-5p inhibitor和miR-374b-5p mimic均購自廣州市銳博生物科技有限公司；MTS購自美國Biovision公司；6孔板和Transwell小室等均購自美國Corning公司；Boyden基質膠購自美國BD公司。

1.3qRT-PCR 采用TRIzol裂解氯仿提取法獲得組織和細胞中的總RNA。按照反轉錄試劑盒說明書將總RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，按qRT-PCR試劑盒說明進行PCR擴增。PCR反應條件：95℃預變性5 s，95℃變性5 s、60℃退火30 s，共40個循環。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-374b-5p的相對表達量；以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算ING1 mRNA的相對表達量。引物序列分別為miR-374b-5p：F:5′- TCAGCGGATATAATACAACCTGC-3′, R:5′-TATCGTTGTTCTCCACTCCTTCAC-3′。U6: F:5′-CTCGCTTCGGCAGCACAING1-3′, R:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。 ING1:F: 5′- AACAACGAGAACCGTGAGAAC-3′, R:5′-TGGTTGCACAGACAGTACGTG-3′。內參GAPDH: F: 5′- ACAACTTTGGTAT CGTGGAAGG-3′, R:5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。

1.4細胞培養及轉染 將MCF-7和MCF 10A細胞接種于含10%FBS的RPMI 1640培養基中，MDA-MB-231細胞接種于含10% FBS的L-15培養基中，HCC1937 細胞接種于含10% FBS的DMEM-F12培養基中，培養均在37℃、5%CO2培養箱中進行。根據qRT-PCR結果，選取miR-374b-5p表達水平最高的乳腺癌細胞用于轉染，細胞融合度為90%時，胰酶消化以2×105個/孔接種于6孔板中，分為對照組和miR-374b-5p inhibitor組，按照說明書將試劑轉染至細胞中，細胞轉染48 h后采用qRT-PCR驗證miR-374b-5p inhibitor沉默效果。對照組的序列為 5′-CAGUACUUUUGUGUA UACAA-3′； miR-374b-5p inhibitor組的序列為 5′-CACUUAGCAGGUUGUAUUAUAU-3′。

1.5MTS增殖實驗 細胞生長至對數期時，胰酶消化以3000個/孔接種于96孔板中，每組設6個復孔，按照轉染說明書將對照組和miR-374b-5p inhibitor轉染至細胞中，繼續培養72 h，棄掉培養基，每孔加入100 μl培養基和20 μl MTS工作液(MTS∶PMS=20∶1)，置于細胞培養箱孵育2 h，全波長酶標儀檢測490 nm波長處樣品OD值。細胞增殖抑制率= (miR-374b-5p inhibitor組OD值-對照組OD值) /對照組OD值×100%。

1.6Boyden實驗 45 μl BD基質膠鋪至Transwell小室聚碳酸酯微孔膜上，放置細胞培養箱中使膠由液體變為固態備用，收集轉染48 h后的各組細胞胰酶消化計數，無血清培養基洗3次，細胞濃度調整為1×106個/ml，100 μl細胞懸液接種于Transwell小室基質膠上，500 μl完全培養基加入下室作為趨化因子，放置培養箱中培養，細胞通過基質膠穿過聚碳酸酯膜小孔，下室穿過10個細胞時終止培養，PBS將微孔膜上室面細胞洗掉，甲醇固定15 min，蘇木素染色20 min。隨機計數顯微鏡下5個視野的穿膜細胞數，并拍照。

1.7Transwell小室實驗 收集轉染48 h后的各組細胞胰酶消化計數，無血清培養基洗3次，細胞濃度調整為1×106個/ml，100 μl細胞懸液接種于Transwell小室聚碳酸酯微孔膜上室面上，500 μl完全培養基加入下室作為趨化因子，放置培養箱中培養，細胞直接穿過聚碳酸酯膜小孔，下室穿過10個細胞時終止培養，PBS將微孔膜上室面細胞洗掉，甲醇固定15 min，蘇木素染色20 min。隨機計數顯微鏡下5個視野穿膜細胞數，并拍照。

1.8miR-374b-5p靶向調節ING1 本研究采用TargetScan7.1軟件(http://www.targetscan.org/)預測miR-374b-5p的靶基因。雙熒光素酶報道基因實驗分別將以下4組共轉染到細胞中：ING1-wt(野生型)與miR-374b-5p mimic共轉染組(ING1-wt+miR-374b-5p)；ING1-wt與對照共轉染組(ING1-wt+NC)；ING1-mut(突變型)與miR-374b-5p mimic共轉染組(ING1-mut+miR-374b-5p)；ING1-mut與NC共轉染組(ING1-mut+對照)，收集轉染48 h的細胞，根據雙熒光素酶報道基因檢測試劑盒說明書檢測各組熒光素酶活性。

2 結果

2.1qmiR-374b-5p在乳腺癌組織和細胞系中的表達水平 miR-374b-5p在乳腺癌組織中的表達為1.82±1.01，癌旁組織中的表達為1.04±0.53；乳腺癌組織中miR-374b-5p的表達水平顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1A。miR-374b-5p在乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231、HCC1937中的表達水平分別為21.62±2.45、5.72±0.68、10.58±0.93，miR-374b-5p在正常乳腺細胞系MCF 10A中的表達水平為1.00±0.00。miR-374b-5p在乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231、HCC1937中的表達水平顯著高于正常乳腺細胞系MCF 10A，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1B。因此選取表達水平最高的MCF-7細胞用于后續實驗。

圖1 miR-374b-5p在乳腺組織和乳腺細胞系中的表達水平比較

A.乳腺癌組織和癌旁組織中miR-374b-5p表達；B.miR-374b-5p在乳腺癌細胞系和正常乳腺細胞系中的表達；與癌旁組織比較，aP<0.05；與MCF 10A細胞系比較，cP<0.05

2.2轉染miR-374b-5p inhibitor的干擾效果比較 miR-374b-5p inhibitor轉染MCF-7細胞48 h后，miR-374b-5p在miR-374b-5p inhibitor組細胞中的表達水平為0.21±0.04，在對照組細胞中的表達水平為1.00±0.05，2組miR-374b-5p表達水平比較差異有統計學意義(P<0.05)。表明miR-374b-5p inhibitor明顯干擾了MCF-7細胞中miR-374b-5p的表達，可進行后續實驗。

2.3干擾miR-374b-5p表達對乳腺癌細胞增殖的影響 對照組細胞增殖率為(100.00±5.00)%，miR-374b-5p inhibitor組細胞增殖率為(29.30±4.27)%；與對照組比較miR-374b-5p inhibitor組細胞增殖率降低(P<0.05) 。見圖2。

圖2 干擾miR-374b-5p表達對乳腺癌細胞增殖的影響

與對照組比較，aP<0.05

2.4干擾miR-374b-5p表達對乳腺癌細胞侵襲的影響 對照組細胞穿膜數為(52.34±11.14)個，miR-374b-5p inhibitor組穿膜數為(18.24±7.62)個；與對照組比較，miR-374b-5p inhibitor組細胞侵襲能力降低，差異有統計學意義(P<0.05) 。見圖3。

圖3 干擾miR-374b-5p表達對乳腺癌細胞侵襲的影響(HE×400)

2.5干擾miR-374b-5p表達對乳腺癌細胞轉移的影響 對照組細胞穿膜數為(38.94±10.35)個，miR-374b-5p inhibitor組穿膜數為(16.31±8.24)個；與對照組比較，miR-374b-5p inhibitor組細胞轉移能力降低(P<0.05) 。見圖4。

圖4 干擾miR-374b-5p表達對乳腺癌細胞轉移的影響(HE×400)

2.6miR-374b-5p對ING1的調控作用 TargetScan7.1軟件在線預測顯示ING1啟動子區有miR-374b-5p的結合位點，可能是miR-374b-5p的靶基因。見圖5A。與ING1-wt+對照共轉染組相比，ING1-wt+miR-374b-5p共轉染組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；ING1-mut+對照組和ING1-mut+miR-374b-5p組熒光素酶活性比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5B。與對照轉染組比較，miR-374b-5p mimic組細胞中ING1 mRNA表達水平下降(P<0.05)。見圖5C。

圖5 miR-374b-5p對ING1的靶向調控作用

A.TargetScan7.1軟件預測ING1與miR-374b-5p結合位點；B.雙熒光素酶報道基因試驗檢測miR-374b-5p靶向ING1在對照組和miR-374b-5 mimic組的表達水平；C.qRT-PCR檢測ING1 mRNA在對照組和miR-374b-5 mimic組的表達水平；ING1為生長抑制因子1，ING1-wt為野生型ING1，ING1-mut為突變型ING1；與對照組比較，aP<0.05

3 討論

乳腺癌具有高發病率、高復發率和高病死率的特點，嚴重威脅了女性健康[1-2]。近年來乳腺癌發病率持續增加，且該病診斷年齡具有年輕化趨勢[12]。乳腺癌治療包括手術、化療、放療、內分泌治療和靶向治療等，有效地改善了患者預后，但是高復發率和高轉移導致該類患者的存活率仍然很低，因此尋找乳腺癌新的治療靶點仍是研究的熱點[3-4]。研究報道，miRNAs在乳腺癌發病過程中具有重要調控作用；miRNAs雖然在多個物種中僅占基因組的1%左右，但其可調控人類基因組中超過60%的編碼蛋白質基因[13]，既往研究表明，miRNAs模擬物或抑制劑可作為治療腫瘤的藥物[6-7]，miRNAs在乳腺癌中作為治療靶點同樣具有應用前景。

miR-374b-5p是新近發現的miRNAs，其異常表達與包括惡性腫瘤在內的多種人類疾病有關。Li等[8]報道，miR-374b-5p抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和上皮-間質轉化(EMT)，并使腫瘤細胞對順鉑治療的敏感性增強。miR-374b-5p在胃癌細胞系中表達增加，并可促進胃癌細胞的轉移、侵襲和增殖[9]。miRNAs分為促進腫瘤miRNAs和抑制腫瘤miRNAs，但是miRNAs在不同腫瘤中發揮的作用可能不同。文獻報道，在三陰乳腺癌(TNBC)中高表達水平的miR-374b-5p與患者預后好相關，在TNBC細胞系中恢復miR-374b-5p的表達抑制細胞的增殖和侵襲[9-10]。Zhang等[14]采用miRCURY TM LNAq芯片技術檢測出乳腺癌患者與健康對照人全血中171個差異表達的miRNAs，并用qRT-PCR驗證了miR-374b-5p是乳腺癌患者全血中上調的5個miRNAs之一。本研究同樣采用qRT-PCR檢測，發現miR-374b-5p在乳腺癌組織中的表達高于癌旁組織，提示miR-374b-5p在乳腺癌中可能為促癌miRNAs，與有關TNBC的報道[10]不一致。TNBC屬于乳腺癌的一種特殊類型，其發病機制、治療方法及預后均與普通乳腺癌不同，因此miR-374b-5p在TNBC和普通乳腺癌中發揮的作用可能不一樣。文獻報道，miR-374b-5p在多種腫瘤中表達異常，并具有生物學功能。本研究結果顯示，miR-374b-5p在乳腺癌組織中高表達，其在乳腺癌中的功能引起本課題組的關注；為此本研究首先檢測了miR-374b-5p在乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231、HCC1937和正常乳腺細胞系MCF 10A中的表達，與正常乳腺細胞相比，其在乳腺癌細胞中的表達均顯著增加，這一結果與在組織水平中的表達具有一致性。miRNAs inhibitor為有效的腫瘤治療抑制劑，在MCF-7細胞中轉染inhibitor抑制miR-374b-5p的表達后，MTS、Boyden實驗和Transwell小室實驗檢測結果顯示細胞增殖、侵襲和轉移能力均降低，以上結果說明miR-374b-5p可能促進乳腺癌的發生發展。miR-374b-5p具體的調控機制需進一步研究。

研究報道，在所有miRNAs中，一半以上通過直接靶向癌基因或腫瘤抑制基因參與腫瘤的發生發展，miRNAs通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區結合，通過在轉錄后水平調控靶基因的表達發揮作用，其靶基因可有數十個到數百個[15]，TargetScan7.1生物信息學軟件預測ING1基因3′非翻譯區有miR-374b-5p的結合位點，ING1屬于Ⅱ型腫瘤抑制因子的ING家族，其中ING1是最具特征的成員，編碼四種蛋白異構體[15]。ING1表達缺失涉及多種人類腫瘤類型，包括胃癌、前列腺癌和肝癌等[16-19]。據報道ING家族的其他成員，特別是ING4，與乳腺癌的發生發展密切相關[20-21]。Thakur等[22]報道了ING1水平降低與乳腺癌患者轉移增加相關。ING1在非小細胞肺癌細胞中作為miR-500和miR-628的直接靶基因抑制腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和黏附，并可誘導腫瘤細胞凋亡[23]。本研究中采用雙熒光素酶報告基因試驗證實ING1為miR-374b-5p直接調控的靶基因，并發現miR-374b-5p mimic抑制MCF-7細胞中ING1 mRNA的表達，表明miR-374b-5p在乳腺癌中可能通過直接作用于靶基因ING1促進乳腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移，但還需深入研究確認。

綜上所述，miR-374b-5p在乳腺癌組織和細胞中表達相對較高，抑制miR-374b-5p的表達，降低了乳腺癌細胞增殖、侵襲和轉移能力，ING1是miR-374b-5p調控的直接靶基因。本課題組推測miR-374b-5p通過靶向抑制ING1的表達促進乳腺癌的增殖、侵襲和轉移能力。miR-374b-5p可能是潛在的乳腺癌治療靶標。