甘西鼠尾草總酚酸提取物對輻射損傷大鼠的保護作用

楊 陽，駱曉梅，王 冬，王路路，周忠海，朱 斌

二十一世紀核科學與核技術迅猛發展并持續進步，在工農業生產與國防建設、生命科學與醫學生物學等諸多領域發揮著不可替代的重要作用。一方面，日常工作生活中，人們與放射線接觸的概率逐漸增多，遭受輻射損傷的概率也隨之增多。另一方面，當前國內惡性腫瘤發病率居高不下，放射治療技術已成為惡性腫瘤常規療法之一；但放療缺乏特異性，既能殺死腫瘤細胞，也可損傷正常細胞。因此，亟待科研工作者尋找開發高效低毒、使用方便的抗輻射藥物。當前研發的抗輻射藥物普遍存在治療窗窄、不良反應多、選擇性不高等安全性問題[1]。例如，氨磷汀具有良好的輻射防護作用，但不良反應較大[2]；洛伐他汀低劑量時為細胞輻射保護劑，但高劑量時可能成為輻射增敏劑，使用劑量難以控制[3]；富勒烯及其衍生物具有很強的自由基清除能力，但水溶性極低，生物毒性較大，嚴重限制了其在生物領域的應用[4]；碘化鉀能保護受到輻射損害的甲狀腺組織，但起效時間要求高，須在6 h內使用[5]。天然藥物及民族藥物具有療效確切、不良反應小、資源豐富等優點[6]，在抗輻射方面因其獨特的治療效果與作用機制受到科研人員的廣泛關注，目前已成為國內輻射防治藥物研究的主要方向。

甘西鼠尾草為唇形科鼠尾草屬植物甘西鼠尾草的干燥根和根莖，為區域性藥材，具有調經、活血、散瘀、鎮靜止痛的功效[7-8]。甘西鼠尾草與其同屬植物丹參具有相似的丹參酮類、酚酸類化學成分，因而藥理作用相似，常常被作為丹參的替代品[9-10]。現代醫藥學研究表明，甘西鼠尾草主要含有揮發油、脂溶性二萜醌類和水溶性酚酸類等化學成分[11-12]，主要活性成分丹參酮ⅡA、迷迭香酸的含量均高于丹參[13-14]；具有保護缺氧/復氧損傷心肌細胞、醛糖還原酶抑制活性、抗氧化、抗菌等多種藥理作用[15-18]。本課題組長期致力于甘西鼠尾草研究，采用大孔吸附樹脂柱色譜的固定工藝技術，制備了質量可控的甘西鼠尾草總酚酸提取物(Salviaprzewalskiitotal phenolic acid extract， SPE)[19]，主要含有迷迭香酸和丹酚酸B等水溶性酚酸類成分[14,20]。本研究通過低劑量輻射動物模型實驗，證實了SPE對大鼠輻射損傷具有保護作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 Quintix 224-1CN型電子分析天平(最大載荷220 g，分度值0.1 mg)，德國Sartorius公司產品。UTP-313型電子天平(最大載荷2000 g，分度值0.01 g)，上海花潮電器公司產品。Minispin 5452型高速離心機，德國Eppendorf公司產品。BC-5390CRP型全自動細胞計數儀，邁瑞醫療國際公司產品。2300C/D SN416型直線加速器治療機(精度99.8%)，美國Varian公司產品，陸軍第七十一集團軍醫院放療科裝機使用。羧甲基纖維素鈉(安徽山河藥用輔料公司生產，批號：130906)。肝素鈉注射液(江蘇萬邦生化醫藥集團生產，批號：20120913)。生理鹽水(安徽省五環藥業公司生產，批號：130617701)。水為雙蒸水，乙醇為醫用級(提取用)，其他試劑為分析純。

1.2實驗藥物 SPE本課題組自制(1 g SPE相當于原藥材55.6 g)，批號：200909-b15，經高效液相法含量測定(校正曲線法)，迷迭香酸的含量為31.58%、丹酚酸B的含量為5.52%[14]。使用前將SPE與1% 羥甲基纖維素鈉(CMC-Na)水溶液混懸均勻，配制成濃度為5、10、20 mg/ml的溶液，現配現用。空白對照溶液為1% CMC-Na水溶液。

1.3實驗動物 雄性SD大鼠，2～3周齡，體質量190～220 g，40只，清潔級，徐州醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(蘇)2015-0009、SYXK(蘇)2015-0030。飼養于陸軍第七十一集團軍醫院實驗中心動物房，飼養溫度24～28℃，相對濕度60%～80%，通風良好。

1.4分組及輻射實驗 取SD大鼠40只，自由進食飲水，適應性飼養，2/d。隨機分為正常對照組(N組)，輻射模型組(M組)和SPE低劑量組(SPE1組)、SPE中劑量組(SPE2組)、SPE高劑量組(SPE3組)，每組8只。除N組不予輻射外，其余各組大鼠均接受直線加速器X射線源6 MV一次全身均勻輻射，源皮距100 cm，輻射面積30 cm×30 cm，輻射劑量率為300 cGy/min。輻射劑量根據參考文獻確定為6 Gy[21]。輻射時，使用本課題組研制的實驗鼠批量均勻輻射的固定裝置；該固定裝置能一次性對多只大鼠進行均勻輻射，可保證輻射劑量一致并提高了輻射效率[22]。輻射后，按照10 ml/kg的給藥體積，SPE1組、SPE2組、SPE3組大鼠分別灌胃給予SPE溶液5、10、20 mg/ml，N組和M組大鼠分別灌胃給予空白對照溶液，1/d，連續給藥34 d。

1.5觀察指標及測定方法

1.5.1大鼠體征及體質量測定：于輻射前1 d及輻射后1、4、7、14、21、28、35 d給藥前觀察各組大鼠體征變化，并使用電子天平稱定大鼠體質量。

1.5.2外周血常規測定：于輻射前1 d及輻射后1、4、7、14、21、28、35 d給藥前取各組大鼠眼內眥靜脈血20 μl，肝素抗凝，使用全自動細胞計數儀測定其紅細胞、血紅蛋白、白細胞、血小板等指標。采血時注意消毒，防止感染。

1.5.3臟器系數測定：輻射后35 d給藥前采血完畢后，頸椎脫臼處死大鼠，立即解剖，分離心臟、肺臟、腎臟、肝臟、脾臟、胸腺、睪丸，使用電子分析天平分別精密稱定各組大鼠以上臟器質量，計算各組大鼠的各臟器系數。臟器系數計算方法為：臟器系數=大鼠臟器質量/大鼠體質量。

2 結果

2.1大鼠體征變化情況 輻射后1、4、7、14、21、28、35 d，N組大鼠活動活躍，毛色顯光澤、無黏滯，食欲無明顯下降，無松毛、脫毛。M組大鼠輻射后1、4、7 d 及SPE各組大鼠輻射后1、4 d 活動遲緩，毛色無光澤、顯黏滯，食欲不振，松毛脫毛，便稀。輻射后7 d，SPE各組大鼠體征略有恢復。輻射后14 d，M組略有恢復，SPE各組大鼠持續好轉。輻射21 d后,M組、SPE各組大鼠均持續好轉，以SPE各組大鼠好轉更為明顯。

2.2大鼠體質量比較 輻射前1 d、輻射后1 d各組大鼠體質量比較差異均無統計學意義(P>0.05)。輻射后4 、7、14、21、28、35 d，N組大鼠體質量不同程度升高，且高于其他各組(P<0.05，P<0.01)。輻射后4 d，M組和SPE各組大鼠體質量均不同程度下降；輻射后7 d，M組大鼠體質量繼續下降，SPE各組大鼠體質量不同程度恢復，SPE1組、SPE2組、SPE3組大鼠體質量高于M組(P<0.05)，且SPE3組與M組具有極顯著差異性(P<0.01)。表明：輻射后4 d起嚴重影響大鼠體質量，體質量持續下降且以7 d為最低；口服1周的SPE能夠抑制輻射大鼠體質量下降，僅高劑量SPE作用明顯。

輻射后14、21、35 d，M組和SPE各組大鼠體質量不同程度恢復。輻射后21、28、35 d，SPE2組、SPE3組大鼠體質量顯著高于M組(P<0.05)，且SPE3組與M組具有極顯著性差異(P<0.01)。表明：口服SPE 2周以上，可明顯促進輻射大鼠體質量恢復，并呈現出量效正相關性；口服5周的SPE能使輻射大鼠體質量恢復至正常水平，且高劑量SPE作用更顯著。以上結果見圖1。

圖1 5組大鼠輻射前后體質量比較

N組為正常對照，M組為輻射模型，SPE1組為甘西鼠尾草總酚酸提取物(SPE)50 mg/kg，SPE2組為SPE 100 mg/kg，SPE3組為SPE 200 mg/kg；與N組比較，aP<0.05，bP<0.01；與M組比較，cP<0.05，dP<0.01

2.3大鼠外周血常規指標比較

2.3.1紅細胞計數比較：輻射前1 d、輻射后1、4 d，各組大鼠紅細胞計數比較差異均無統計學意義(P>0.05)。輻射后1、4 、7、14 d，N組大鼠紅細胞有所增多，其余各組大鼠紅細胞均不同程度減少。輻射后7、14 d，N組大鼠紅細胞顯著高于M組、SPE各劑量組(P<0.05,P<0.01)。表明：輻射后4 d內大鼠紅細胞無明顯影響；輻射后1周起大鼠紅細胞損傷嚴重，紅細胞持續減少且以14 d為最低。

輻射后21～28 d，N組大鼠紅細胞持續增多，其余各組大鼠紅細胞略有恢復。N組大鼠紅細胞顯著高于M組、SPE各劑量組(P<0.01，P<0.05)，SPE2組、SPE3組大鼠紅細胞高于M組(P<0.05)。輻射后35 d，N組大鼠紅細胞高于M組(P<0.01)，但與SPE各劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05);SPE各劑量組大鼠紅細胞高于M組(P<0.05)。表明：口服3周以上的SPE對輻射大鼠紅細胞損傷具有明顯保護作用；口服5周的SPE能夠使輻射大鼠紅細胞損傷恢復至正常水平。以上結果見表1。

表1 5組大鼠外周血紅細胞比較

注：N組為正常對照，M組為輻射模型，SPE1組為甘西鼠尾草總酚酸提取物(SPE)50 mg/kg，SPE2組為SPE 100 mg/kg，SPE3組為SPE 200 mg/kg；與N組比較，aP<0.05，bP<0.01；與M組比較，cP<0.05

2.3.2血紅蛋白比較： 輻射前1 d、輻射后1 d，各組大鼠血紅蛋白之間的差異均無統計學意義(P>0.05)。輻射后4 ～14 d，N組大鼠血紅蛋白持續略有升高，M組和SPE各劑量組血紅蛋白均呈不同程度下降。輻射后4 d，N組大鼠血紅蛋白顯著高于M組(P<0.01)。輻射后7、14 d，N組大鼠血紅蛋白顯著高于M組、SPE各劑量組(P<0.01)。表明：輻射后4 d起嚴重影響大鼠血紅蛋白，血紅蛋白持續下降且以14 d為最低。

輻射后21～35 d，N組大鼠血紅蛋白持續升高，其余各組血紅蛋白均呈不同程度恢復。輻射后21、28 d，N組大鼠血紅蛋白顯著高于M組、SPE各劑量組(P<0.01)；而輻射后35 d，N組大鼠血紅蛋白僅高于M組、SPE1組(P<0.01)。輻射后21～35 d，SPE2組、SPE3組大鼠血紅蛋白顯著高于M組(P<0.01)。表明：口服3周以上的SPE對輻射大鼠血紅蛋白損傷具有明顯保護作用，并呈現出量效正相關性；口服5周的中高劑量SPE能夠使輻射大鼠血紅蛋白損傷恢復至正常水平。以上結果見表2。

表2 5組大鼠外周血血紅蛋白比較

注：N組為正常對照，M組為輻射模型，SPE1組為甘西鼠尾草總酚酸提取物(SPE)50 mg/kg，SPE2組為SPE 100 mg/kg，SPE3組為SPE 200 mg/kg；與N組比較，bP<0.01；與M組比較，dP<0.01，cP<0.05

2.3.3白細胞比較：輻射前1 d，各組大鼠白細胞比較差異均無統計學意義(P>0.05)。輻射后1、4 d，N組大鼠白細胞增多，其余各組大鼠白細胞均呈不同程度減少。輻射后1、4 d，N組大鼠白細胞顯著高于M組、SPE各劑量組(P<0.01)。表明：大鼠白細胞對輻射損傷較為敏感，輻射后1 d即發生大鼠白細胞嚴重損傷，白細胞持續減少且以4 d為最低。

輻射后7～35 d，N組大鼠白細胞繼續增多，其余各組白細胞略有恢復。N組大鼠白細胞仍顯著高于M組、SPE各劑量組(P<0.01)。表明：口服5周的SPE對輻射大鼠白細胞損傷無保護作用。以上結果見表3。

表3 5組大鼠外周血白細胞比較

注：N組為正常對照，M組為輻射模型，SPE1組為甘西鼠尾草總酚酸提取物(SPE)50 mg/kg，SPE2組為SPE 100 mg/kg，SPE3組為SPE 200 mg/kg；與N組比較，bP<0.01

2.3.4血小板比較 ：輻射前1 d各組大鼠血小板比較差異均無統計學意義(P>0.05)。輻射后1～7 d，N組大鼠血小板無明顯變化，其余各組大鼠血小板均不同程度減少。輻射后4、7 d，N組大鼠血小板顯著高于M組、SPE各劑量組(P<0.01)。表明：輻射后4 d起發生大鼠血小板嚴重損傷，血小板持續減少且以7 d為最低。

輻射后14～35 d，N組大鼠血小板無明顯變化，其余各組大鼠血小板均不同程度恢復。輻射后14 d，N組大鼠血小板顯著高于M組、SPE各劑量組(P<0.01)。輻射后21～35 d，N組大鼠血小板仍顯著高于M組(P<0.01)，但N組大鼠與SPE各劑量組之間的差異無統計學意義(P>0.05)。輻射后21 d，SPE各劑量組大鼠血小板顯著高于M組(P<0.05)。表明：口服3周SPE對輻射大鼠血小板損傷具有明顯保護作用，并呈現出量效正相關性；口服3周以上SPE能使輻射大鼠血小板損傷恢復正常水平。以上結果見表4。

表4 5組大鼠外周血血小板數值比較

注：N組為正常對照，M組為輻射模型，SPE1組為甘西鼠尾草總酚酸提取物(SPE)50 mg/kg，SPE2組為SPE 100 mg/kg，SPE3組為SPE 200 mg/kg；與N組比較，bP<0.01；與M組比較，cP<0.05

2.4臟器系數比較 輻射后35 d，各組大鼠心臟系數、肺臟系數、腎臟系數、胸腺系數之間的差異均無統計學意義(P>0.05)。N組大鼠睪丸系數顯著高于M組、SPE各劑量組(P<0.01)；SPE各組大鼠睪丸系數與M組比較差異無統計學意義(P>0.05)。表明：輻射對大鼠心臟、肺臟、腎臟、胸腺無明顯損傷；輻射對大鼠睪丸的損傷影響較為嚴重，口服5周的SPE對輻射大鼠睪丸損傷無保護作用。

輻射后35 d，M組大鼠肝臟系數、脾臟系數均顯著低于N組(P<0.01)；SPE2組、SPE3組大鼠脾臟系數與N組比較差異無統計學意義(P>0.05)，SPE3組大鼠肝臟系數顯著高于M組(P<0.05)；SPE2組、SPE3組大鼠脾臟系數顯著高于M組(P<0.05)。表明：輻射對大鼠肝臟、脾臟損傷較為嚴重；口服5周的中高劑量SPE對輻射大鼠肝、脾損傷具有明顯保護作用，能夠使其恢復至正常水平。以上結果見圖2。

圖2 5組大鼠臟器系數比較

N組為正常對照，M組為輻射模型，SPE1組為甘西鼠尾草總酚酸提取物(SPE)50 mg/kg，SPE2組為SPE 100 mg/kg，SPE3組為SPE 200 mg/kg；與N組比較，bP<0.01；與M組比較，aP<0.05

3 討論

文獻報道，大劑量單次電離輻射能引起皮膚灼傷、毛發脫落、骨髓抑制、DNA損傷等嚴重的輻射反應，致使輻射患者短期內死亡[23]。電離輻射損傷的主要機制是輻射致使機體生成過多的氧自由基[24-25]。過多的氧自由基能引起脂質過氧化反應，產生的代謝產物可直接攻擊生物大分子物質，造成細胞結構破壞及功能的紊亂，從而對機體造成嚴重的損傷[26]。甘西鼠尾草能降低脂質過氧化物丙二醛的含量，顯著抑制羥自由基的產生，并抑制脂質過氧化反應[27]。本課題組制備的SPE中，迷迭香酸及丹酚酸B的含量較高，且為主要活性化合物。迷迭香酸為咖啡酸與3,4-二羥基苯基乳酸縮合而成的酯，分子結構中含有較多的酚羥基；具有較強的抗氧化、抗炎、抗過敏[28-30]等生理活性。迷迭香酸是一種抵御紫外線及其他電離輻射優良的防護劑，其防護作用與抑制炎癥反應、消除活性氧自由基的機制相關[31]。迷迭香酸還可減輕X射線誘導的人真皮微血管內皮細胞增殖抑制和凋亡，提高細胞內抗氧化能力、清除活性氧以改善細胞內的氧化脅迫[32]。丹酚酸B是咖啡酸的四聚體化合物，是有效的自由基清除劑和抗氧化劑[33]。本實驗結果表明，SPE具有提高輻射損傷大鼠體質量，增加紅細胞、血紅蛋白、血小板數量，改善肝臟損傷、脾臟損傷等抗輻射損傷作用。迷迭香酸、丹酚酸B等結構中含有多酚羥基的酚酸類化合物是SPE具有輻射損傷保護作用的物質基礎，其作用機制主要是抗氧化作用及清除氧自由基作用。

輻射作用機體后，血液系統及造血系統最早發生改變，主要是抑制或破壞造血干細胞和增殖池細胞的增殖能力，造成造血功能低下或衰竭，誘發感染、貧血、出血等并發癥[34]。實驗鼠遭受X射線輻射后，鼠體短期內會出現代謝失常、造血功能破壞等癥狀，引起紅細胞、白細胞、血小板等血細胞數量下降，然后會逐漸恢復[35]。本實驗亦證實了以上損傷及恢復過程，大鼠在遭受非致命輻射損傷后，其體質量、紅細胞、血紅蛋白、白細胞、血小板等指標短期內均顯著下降，但同時，由于大鼠自身適應與調節機制，以上損傷經過一段時間后能夠在一定程度上自我修復。本實驗結果顯示，SPE能顯著縮短大鼠體質量、紅細胞、血紅蛋白、血小板等損傷的恢復時間，并顯著提高損傷恢復的程度和效果，但對白細胞損傷無明顯保護作用。表明，SPE促進了輻射大鼠體征持續好轉，強壯體質，能夠顯著提高體質量，口服5周SPE，其體質量可恢復至正常水平。

大鼠遭受急性輻射時，骨髓造血功能受損，即發生血小板生成障礙，致血小板急劇減少，影響凝血和止血功能。同時，脾臟在病態及大失血后能應激產生各種血細胞。輻射1周后，大鼠造血功能開始修復，新生成的血小板主要通過脾臟貯存，再進入循環系統，以維持血液中的正常量。本實驗證實，SPE對輻射大鼠脾臟具有一定的保護作用，可能通過強化脾臟造血功能生成、增加脾臟內新生成血小板與循環系統血小板交換的生理功能，促進輻射大鼠血小板損傷的恢復。本課題組前期研究表明SPE能夠明顯降低大鼠全血黏度、改善血液循環狀態[36]。迷迭香酸具有抗血栓和抗血小板聚集作用，體內可阻抑膠原誘導的血小板聚集，促進纖維蛋白溶解活性[37]；丹酚酸B對家兔血漿黏度、紅細胞壓積和聚集指數具有明顯的降低作用，可導致家兔血液黏度降低[38]。因此，SPE能夠保護損傷的血小板，可能與其迷迭香酸、丹酚酸B含量較高，且具有降低全血黏度的藥理作用有一定的關聯。

文獻報道，迷迭香酸能抑制羥自由基致小鼠肝臟線粒體氧化損傷，提高線粒體膜流動性，增強琥珀酸脫氫酶活性[39]，且對四氯化碳致小鼠急性肝損傷具有保護作用，能降低小鼠血清谷丙轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶活性、甘油三酯含量，減輕肝臟炎癥反應，改善肝纖維化[40-41]。迷迭香酸具有免疫調節功能[30,42]，能增強脾臟造血功能，有效保護脾臟等免疫器官[43]。本實驗證實了SPE對輻射大鼠肝、脾損傷具有保護作用，對于輻射損傷后促進肝臟新陳代謝、脾臟細胞和體液免疫的功能恢復，維持機體正常的生理功能，防止嚴發生重感染具有積極的意義。本課題組前期研究表明SPE具有溫和的利尿作用[36]。因此，SPE可加速損傷代謝物及毒素經尿排出體外，有利于輻射后機體紊亂內環境的快速修復。已有研究證實，丹參水溶性有效活性部位丹參多酚酸鹽對輻射造成的血管內皮細胞損傷具有明顯的保護作用，能夠增加輻射損傷細胞中的超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛含量，減少細胞凋亡[44]；丹參水溶性提取成分丹參素也具有極強的抗氧化及清除自由基的活性[45]。此外，迷迭香酸的毒性較低，小鼠靜脈注射給藥的半數致死量僅為561 mg/kg[46]。

綜上所述，甘西鼠尾草作為丹參的同屬植物，其總酚酸提取物對于大鼠輻射損傷具有良好的保護作用，療效明確且安全，臨床應用前景良好。下一步，應繼續進行深入研究，有望將其開發成為一種低毒高效、價廉質優、服用方便的抗輻射天然藥物。