過氧乙酸戊二醛復方消毒劑對蠟樣桿菌芽孢殺菌效果評估

彌成龍，郭 亮，鄭明學，白 瑞，史晨婕，張 黎，鄭龍龍，郝飛飛，馮玉萍，康慧鑫，張雪松

（山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801）

蠟樣桿菌是與炭疽桿菌密切相關的細菌，對人和動物具有致病性[6]。芽孢是某些細菌在一定條件下，胞質脫水在菌體內形成具有多層膜包囊的圓形或卵圓形小體，是細菌避開不良環境、維持細菌生存處于代謝相對靜止的休眠體。蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）屬芽孢桿菌屬（Bacillus），為需氧芽孢桿菌，俗稱蠟樣桿菌，廣泛分布于自然界，易污染食品[7]。

山西農業大學動物科技學院獸醫病理實驗室復方消毒劑試驗組研制的過氧乙酸戊二醛復方消毒劑（專利申請號碼：CN200910263970.X）可對多種細菌繁殖體、枯草桿菌芽胞、真菌、NDV和IBDV等具有良好的殺滅效果[8-10]，且具有作用迅速、長效、抗干擾能力強且低成本和作用效率高等特點。但復方消毒劑對蠟樣桿菌芽孢的殺滅效果如何，以及與復方消毒劑中含量相同的過氧乙酸、戊二醛和過氧化氫分別對蠟樣桿菌芽孢的殺滅效果如何，目前還不清楚。

本試驗通過復方消毒劑及其與過氧乙酸、戊二醛和過氧化氫對蠟樣桿菌芽孢的殺滅效果比較，旨在為該復方消毒劑的臨床應用奠定理論基礎性數據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株 蠟樣桿菌8008為國家消毒試驗標準菌株，購自中國微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試劑和培養基 30%過氧乙酸（廣東省西隴科技有限公司）；15%過氧化氫（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；50%戊二醛（國藥集團化學試劑有限公司）。過氧乙酸戊二醛復方消毒劑由山西農業大學獸醫病理實驗室提供。普通營養肉湯培養基（上海博微生物科技有限公司）；普通營養瓊脂培養基（上海賓穗生物科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 復方消毒劑對蠟樣桿菌芽孢定性滅菌試驗

于山西農業大學獸醫病理實驗室進行定性滅菌試驗。具體方法為：試驗前將蠟樣桿菌芽孢制備成懸液并活菌計數，用含1%蛋白胨的0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液將菌液稀釋成為5×105～5×106cfu/mL。將復方消毒劑、與復方消毒劑中相同含量的過氧乙酸、過氧化氫、戊二醛和0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液分別以滅菌蒸餾水連續倍比稀釋10次，并分別取2.5 mL細菌懸液，混勻后立即計時，分別作用 5、10、15、30、60min后，各取0.5mL菌藥混合液加入到4.5mL相應的中和劑中，中和10 min后，立即取0.5 mL菌藥中和劑混合液加入至4.5 mL營養肉湯培養基中，取同批試驗未使用完的營養肉湯培養基作為陰性對照組，將上述0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液試驗組作為陽性對照。

37℃恒溫培養箱內培養至第7 d，觀察試管中的營養肉湯培養基是否渾濁。若不渾濁，則說明消毒劑可以殺滅細菌芽孢；若渾濁，則說明不能殺滅細菌芽孢。定性滅菌試驗共重復3次，以無菌生長的最大稀釋倍數作為該消毒劑的最低有效殺菌濃度，最短作用時間為該濃度殺菌最快有效時間。

1.2.2 復方消毒劑對蠟樣桿菌芽孢定量殺滅試驗

a)如果Label[j]>0且medarray[Label(j)]<1，則表示該標號的塊連通域首次被掃描到，則Label_index=Label_index+1；medarray[Label(j)]=Label_index；Label[j]=Label_index。

試驗前用1%蛋白胨的0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液將蠟樣桿菌芽孢懸液稀釋成5×106～5×107cfu/mL。取5個試管分別加入0.5 mL細菌懸液、0.5 mL濃度為0.03 g/mL的牛血清白蛋白、4.0 mL相應濃度的復方消毒劑（依據定性滅菌試驗確定的最低有效殺菌濃度），并設置一個4.0 mL的無菌蒸餾水作為陽性對照組，混勻后將5個試管同時放置在25℃水浴中，作用到定性滅菌試驗中確定的最快殺菌有效時間時，取菌藥混合液0.5 mL加入到4.5 mL相應中和劑中，中和作用10 min后取1.0 mL菌藥中和劑混合液到無菌培養皿中做細菌傾注培養，于37℃恒溫培養箱內培養72 h后活菌計數并計算殺菌率和殺滅對數值。

根據下列公式，計算殺菌率和殺滅對數值，陽性對照組所得結果代表菌液原濃度，以其作為計算殺菌率和殺滅對數值的初始值。殺菌率≥99.9%時，達到消毒效能，殺菌率為100%時，達到殺菌效能；殺滅對數值均≥5.00時，為消毒合格[11-12]。

式中，n0和nt分別為陽性對照組平均活菌數和試驗組平均活菌數；N0和Nx分別為對照組平均活菌濃度的對數值和試驗組活菌濃度對數值。

2 結果與分析

2.1 消毒劑定性殺滅蠟樣桿菌芽孢試驗

復方消毒劑、過氧乙酸、過氧化氫對蠟樣桿菌芽孢的最低有效殺菌濃度分別為3.125%、0.125%、0.600%，該濃度下的最快有效殺菌時間依次為5、5、15 min。復方消毒劑所含戊二醛對蠟樣桿菌芽孢不能完全殺滅。

2.2 消毒劑定量殺滅蠟樣桿菌芽孢試驗

復方消毒劑最低有效殺菌濃度（3.125%）作用5 min可有效殺滅蠟樣桿菌芽孢，殺滅對數值≥5。復方消毒劑含量相同的單一成分的過氧乙酸、過氧化氫分別作用5、15 min可有效殺滅蠟樣桿菌芽孢，殺滅對數值均≥5，但戊二醛（0.06%）在60 min內則無法完全殺滅蠟樣桿菌芽孢，其殺滅對數值為4.08（表 1、2）。

表1 復方消毒劑定量殺滅蠟樣桿菌芽孢的殺滅率 %

表2 復方消毒劑定量殺滅蠟樣桿菌芽孢的殺滅對數值

3 結論與討論

飼養健康動物、提供安全健康的動物產品和獲取最佳的經濟效益是現代養殖業的三大任務，而建立有效的消毒防疫體系至關重要，一個符合當地實際的消毒方案，是現代養殖企業控制疾病、獲取最佳效益的重要措施。

復方消毒劑對蠟樣桿菌芽孢具有良好的殺滅作用，3.125%（32倍稀釋）作用5 min就可殺滅100%的蠟樣桿菌芽孢，與該復方消毒劑含量相同的單一成分除戊二醛外，過氧乙酸（0.125%）作用5 min和過氧化氫（0.6%）作用15 min可有效殺滅蠟樣桿菌芽孢。

過氧乙酸和過氧化氫作為強氧化劑，戊二醛作為蛋白質凝固劑，3種消毒劑不但可以高效殺毒滅菌而且互相存在協同作用[11]；且氧化類消毒劑作用強，殺毒滅菌迅速，同時過氧化氫與過氧乙酸分解產物乙酸再次生成過氧乙酸，增加其殺菌效果[2]。

呂鳳霞等[13]研究表明，1.08%的H2O2作用蠟樣桿菌芽孢60 min，殺滅對數值≥5.00；莫金觀等[14]研究表明，1.0%和1.5%的H2O2分別作用蠟樣芽孢桿菌1.5 min，殺滅對數值分別為2.12和2.86，用1.5%和2.0%的CH3COOOH分別作用蠟樣芽孢桿菌1.5 min，殺滅對數值分別為3.10和≥5.00；李月丹等[15]研究表明，2%的戊二醛對蠟樣桿菌芽孢沒有殺滅效果。本試驗得出的結果與之相似。在本試驗中，0.6%的H2O2和0.125%的CH3COOOH分別作用蠟樣桿菌芽孢5、15min，殺滅對數值均≥5.00，0.06%的戊二醛作用蠟樣桿菌芽孢60 min，殺滅對數值為4.08。表明H2O2和CH3COOOH在一定濃度下對蠟樣桿菌芽孢均有一定的殺菌效果。

洪令瑤等[16]研究表明，用0.0025%的CH3COOOH和0.002 5%的H2O2混合配制成的復方消毒液對蠟樣芽孢桿菌分別作用10、480 min，其殺菌率分別為96.71%、97.08%；本研究中3.125%的過氧乙酸戊二醛復方消毒劑作用蠟樣桿菌芽孢5min，殺菌率可達100%。本試驗結果與之相比，消毒效果更好，消毒更徹底，更適合養殖場的實際生產與實踐，且復方消毒劑的消毒效果優于單一消毒劑的消毒效果。過氧乙酸戊二醛復方消毒劑降低了使用劑量，對人畜的毒性、刺激性大大降低，更適合用于生產實踐。