羊肚菌抗氧化肽的制備、純化和鑒定

范三紅，田 雨，張錦華

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，特色植物資源研究與利用山西重點實驗室，山西太原030006）

羊肚菌作為一種珍稀食藥兼用菌，以其特有的香味和較高的營養(yǎng)價值而受到世界各地的關(guān)注，被評為最珍貴的食用菌之一[1]。羊肚菌具有作為天然藥物的巨大潛力，自發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中使用了幾個世紀，其營養(yǎng)特性在國際上備受推崇，其蛋白質(zhì)含量在20%以上，是一種重要的營養(yǎng)資源[2]。目前，研究表明，羊肚菌具有抗氧化[3]、降血脂、抑腫瘤、抗疲勞等保健功能[4-8]。

多肽是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物，從生物體內(nèi)提取的多肽大多具有較強的活性，特別是其較高的抗氧化性質(zhì)[9-11]。抗氧化肽可以通過抑制生物大分子過氧化和清除體內(nèi)自由基的方式保護人體組織器官，其抗氧化能力是根據(jù)分子供氫的能力和自身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性共同決定的[12]。食物蛋白通過水解作用得到的抗氧化肽具有安全性高、抗氧化性強和易被吸收等特點，故成為當今世界研究的熱點[13-14]。

復(fù)合酶解工藝具有提取快、條件溫和、有效增加提取物質(zhì)活性等特點，目前已經(jīng)被證實，其在大豆蛋白[15]、紫菜藻紅蛋白[16]等提取中具有較好的效果。超聲波可以產(chǎn)生高速、強烈的空化效應(yīng)以及攪拌作用，將這種作用應(yīng)用到輔助酶解過程中，能夠有效地加快酶解進程，加大產(chǎn)物得率[17-18]。周艷華等[19]通過使用復(fù)合酶法使可溶性蛋膜蛋白酶解產(chǎn)物的水解度提高到46.12%。張輝等[20]利用超聲輔助酶解的方法制備了抗氧化性能較高的麥麩多肽，其OH自由基清除率達到83.13%，DPPH自由基清除率為78.86%。

目前，以食物中蛋白酶解生成的小分子多肽為原料，進行產(chǎn)品開發(fā)的思路已經(jīng)被國際社會廣泛關(guān)注，而如何能夠高效提取具有極強生物活性的多肽，也成為研究熱點。

本研究以羊肚菌蛋白為原料，初步研究優(yōu)化超聲輔助復(fù)合酶法制備抗氧化多肽的工藝，并對抗氧化肽的活性及氨基酸序列進行分析，旨在為羊肚菌蛋白的進一步開發(fā)提供思路和支持。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

羊肚菌子實體購于山西省安澤縣惠原科貿(mào)有限公司，品種為褐赭羊肚菌（Morchella umbrina）。

中性蛋白酶（6.0×104U/g）、胰蛋白酶（2.5×105U/g）、堿性蛋白酶（2.0×105U/g）、木瓜蛋白酶（6.0×106U/g）、風(fēng)味蛋白酶（6.0×104U/g）、復(fù)合蛋白酶（1.0×105U/g）、菠蘿蛋白酶（5.0×105U/g）均購于北京索萊寶科技有限公司；DEAE-32、G-25、DPPH均購于美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

SP-2000UV型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；BS-100A自動部分收集器、HD-21-1核酸蛋白檢測儀、TH-1000梯度混合器、BT-100數(shù)顯蠕動泵，上海青浦滬西儀器廠；SB25-12DTD超聲波清洗機，寧波新芝生物科技有限公司；QExactive mass spectrometer，Thermof isher。

1.2 試驗方法

1.2.1 羊肚菌多肽的制備工藝 粉碎適量的羊肚菌子實體（過0.177 mm篩），以料液比1∶30配成混合液（羊肚菌粉∶水），調(diào)節(jié)pH值為11，超聲功率輔助條件為200 W/30 min，在4 000 r/min下離心25 min，取上清液；用1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為4.5，在4 000 r/min下離心25 min，得沉淀；將沉淀反復(fù)水洗后離心分離；最后將得到的蛋白進行冷凍干燥，得到羊肚菌蛋白粉末。將羊肚菌蛋白粉復(fù)溶配成5%的蛋白溶液，調(diào)節(jié)蛋白溶液溫度和pH，超聲輔助下進行酶解，反應(yīng)結(jié)束后置于95℃滅酶10 min，4 000 r/min離心15 min，取上清液，調(diào)節(jié)pH值至中性后冷凍干燥，即得羊肚菌多肽。

1.2.2 復(fù)合酶的篩選

1.2.2.1 單酶酶解試驗 配制質(zhì)量濃度為5%的羊肚菌蛋白溶液，取相同體積（50 mL）溶液分別加入堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶及菠蘿蛋白酶，總加酶量固定為4000U/g，保持各類酶在其最適溫度和pH條件下對底物進行水解。

1.2.2.2 復(fù)合酶的選擇 以DPPH自由基清除率及水解度為參考指標，依托單酶試驗結(jié)果，選用3種蛋白酶進行復(fù)合酶解試驗，酶配比固定為1∶1，繼續(xù)優(yōu)化酶解方案。

1.2.2.3 最佳酶配比確定 在總加酶量為4 000 U/g的條件下，探究復(fù)合酶不同酶活力配比對羊肚菌蛋白酶解產(chǎn)物的影響。

1.2.3 超聲波輔助方法的探究 分別在不加超聲波（空白）、高頻（69.0 kHz）、中頻（47.0 kHz）、低頻（25.0 kHz）及不同功率（200、300、400 W）條件下進行酶解試驗，從而探究超聲波條件對酶解反應(yīng)的影響作用。

1.2.4 羊肚菌蛋白酶解工藝優(yōu)化單因素試驗 基本的超聲輔助酶解條件為：加酶量4 000 U/g，超聲功率為300 W，溫度50℃，pH值為8，時間50 min。在其他條件不變的基礎(chǔ)上，以DPPH自由基清除率（%）為指標，分別選取加酶量 2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 U/g，酶解 pH 值 6、7、8、9、10，酶解時間30、40、50、60、70 min，酶解溫度 40、45、50、55、60 ℃，進行單因素試驗。

1.2.5 羊肚菌蛋白酶解工藝響應(yīng)面實驗 響應(yīng)面實驗設(shè)計水平編碼列于表1。

表1 因素水平編碼

1.2.6 羊肚菌抗氧化多肽產(chǎn)物的純化

1.2.6.1 超濾法分離純化 選用10 ku規(guī)格的超濾膜，在壓力為3.0×104Pa下將羊肚菌多肽酶解液分離為2個組分，冷凍干燥備用。

1.2.6.2 DEAE-32分離純化 選用20 mm×400 mm規(guī)格層析柱，用50 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）的緩沖液平衡柱床，上樣量3 mL，用0～1 mol/L NaCl平衡緩沖液進行梯度洗脫，流速為1.5 mL/min，紫外檢測波長220 nm。

1.2.6.3 Sephadex G-25分離純化 選用16 mm×300 mm規(guī)格層析柱，洗脫條件為：平衡緩沖溶液100 mmol/L、pH值 7.5 的 Tris-HCl，上樣量 3 mL，洗脫流速0.5 mL/min，紫外檢測波長220 nm。

1.2.7 多肽氨基酸序列鑒定 氨基酸序列采用LC-MS-MS質(zhì)譜進行鑒定。參照薛海燕等[21]的方案進行實驗參數(shù)的設(shè)定。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 水解度的測定 參考相關(guān)文獻，堿性和中性環(huán)境下采用pH-Stat法測定水解度；酸性條件下采用甲醛滴定法測定水解度[22]。

1.3.2 DPPH自由基清除率的測定 其參照任嘉興等[23]的羊肚菌多糖抗氧化研究試驗方案進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解方案的確定

各種類蛋白酶單酶酶解情況列于表2。

表2 各種類蛋白酶酶解情況

從表2可以看出，不同蛋白酶水解效果呈現(xiàn)多樣性，其中酶解效果較好的3種酶分別為堿性蛋白酶、胰蛋白酶和復(fù)合蛋白酶，在最適條件下相應(yīng)的水解度（分別為22.24%，19.73%和17.51%）和DPPH自由基清除率（分別為51.43%，47.29%和44.62%）都顯著高于其余蛋白酶。故選用這3種酶進行復(fù)合酶的篩選試驗，其中①為堿性蛋白酶，②為胰蛋白酶，③為復(fù)合蛋白酶（表3）。

表3 復(fù)合酶水解羊肚菌粗蛋白的不同酶解方案及結(jié)果

如表3所示，3種蛋白酶分別以1∶1的比例進行復(fù)合對羊肚菌粗蛋白進行酶解，復(fù)合酶的水解度和DPPH自由基清除率均顯著高于單一酶的作用（表2），其中①＋②的試驗效果最好。對這2種酶進行酶活力配比優(yōu)化，結(jié)果如圖1所示，當堿性蛋白酶∶胰蛋白酶為7∶3時，水解度和DPPH自由基清除率均最大，確定該配比為最佳復(fù)合酶配比。

2.2 超聲波輔助酶解方案的確定

從圖2可以看出，與對照組相比，超聲波頻率在200、300 W時清除率明顯提高，且在頻率為300 W時效果最顯著，這可能是因為超聲空化效應(yīng)的增強，使得底物與酶的接觸更加充分[24]；而當功率達到400 W時，DPPH自由基清除率明顯降低，可能是因為功率太大，導(dǎo)致酶活性的降低和抗氧化多肽的失活。綜合比較酶解反應(yīng)在低、中、高頻的表現(xiàn)，選取超聲波低頻（25.0 kHz）、功率300W為超聲波輔助酶解條件。

2.3 羊肚菌酶解工藝優(yōu)化單因素試驗結(jié)果

從圖3-a可以看出，酶解時間為30～50 min時，DPPH·清除率出現(xiàn)增值的趨勢；當酶解時間達50 min時出現(xiàn)了峰值，可能是由于通過增加酶解時間，蛋白質(zhì)的水解度提高，最終產(chǎn)生大量抗氧化活性的多肽，之后酶解反應(yīng)繼續(xù)進行，一些小分子的多肽水解為氨基酸，從而喪失了抗氧化活性。

從圖3-b可以看出，在所設(shè)置溫度范圍內(nèi)（40～60℃），DPPH·清除率出現(xiàn)先升高后下降的趨勢，酶解溫度55℃為最優(yōu)條件，可能是由于較高的溫度會降低復(fù)合酶的活性，從而使DPPH·清除率降低。

如圖3-c所示，DPPH·清除率受pH影響較大，當pH值為8時，DPPH·清除率達到最高，而當pH值低于8時，隨pH增大清除率呈現(xiàn)上升趨勢，可能是由于較低的pH值對復(fù)合酶活力影響較大；當pH值大于9后，清除率出現(xiàn)了明顯下降，可能是由于較高的pH值導(dǎo)致多肽結(jié)構(gòu)被破壞，從而引發(fā)活性降低。

由圖3-d可知，DPPH·清除率隨加酶量增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當加酶量為3 000 U/g時DPPH·清除率達最大，之后呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，可能是由于過量的加酶量引發(fā)蛋白質(zhì)和小分子多肽的過度水解，生成了不具備活性的氨基酸，從而使得整體清除率下降[25]。綜合全部試驗結(jié)果，確定最適酶解方案為：時間50 min、溫度55℃、pH值8.0、加酶量3 000 U/g。

2.4 超聲波輔助酶解工藝響應(yīng)面分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以酶解時間A（min）、酶解溫度 B（℃）、酶解 pH 值 C、加酶量 D（U/g）為影響因素，以DPPH自由基清除率Y（%）為響應(yīng)值，采用軟件Design-Expert 8.0進行四因素三水平響應(yīng)面實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理，其結(jié)果列于表4。

回歸與方差分析結(jié)果如表5所示。建立二次響應(yīng)面回歸模型如下：Y＝88.38＋4.44A＋5.61B＋6.53C＋3.30D－2.19AB－5.24AC＋1.27AD＋2.34BC＋0.27BD－3.25CD－7.88A2－12.84B2－16.80C2－0.72D2。

從表5可以看出，該模型回歸顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），并且該模型R2＝92.7%，說明該模型與試驗擬合良好。其中，模型A、B、C為極顯著影響因子，D為顯著影響因子，說明影響因素對試驗結(jié)果都具有較為明顯的影響作用。兩因素交互項AC影響顯著，其響應(yīng)面圖如圖4所示。

表4 試驗方案及結(jié)果

表5 回歸與方差分析結(jié)果

通過軟件尋找最優(yōu)超聲輔助酶解工藝條件得到，當酶解時間為60 min、酶解溫度為55.69℃、酶解pH值為7.95、加酶量為4 000 U/g時，得到的酶解多肽DPPH自由基清除率最大，為89.09%。在最優(yōu)超聲輔助條件下，修正溫度為56℃，pH值為8，進行3次驗證試驗，取平均值，DPPH自由基清除率為89.97%，表明試驗值與回歸方程預(yù)測值吻合良好。

2.5 超濾法分離純化羊肚菌多肽的結(jié)果

將小于10 ku和大于10 ku這2個組分冷凍干燥之后配制為0.3 mg/mL的溶液進行測定，結(jié)果如圖5所示，測定結(jié)果顯示，小于10 ku的羊肚菌多肽組分具有更好的DPPH自由基清除作用，清除率為86.43%，所以選擇小于10 ku組分繼續(xù)進行下一步分離純化。

2.6 DEAE-32分離純化羊肚菌多肽的結(jié)果

將超濾得到的小于10 ku的組分進一步經(jīng)DEAE-32分離得到4個洗脫峰，分別命名為組分D1、D2、D3、D4，結(jié)果如圖 6 所示。將各組分冷凍干燥之后配制為0.3 mg/mL的溶液進行測定，結(jié)果顯示，D3組分的清除率最高，為94.57%，故將D3組分作為下一步分離純化研究的對象。

2.7 Sephadex G-25分離純化羊肚菌多肽結(jié)果

將D3組分繼續(xù)經(jīng)過Sephadex G-25分離后得到 3 個洗脫峰，分別命名為 G1、G2、G3（圖 7）。將各組分冷凍干燥后配制為0.3 mg/mL的溶液進行測定，如圖7所示，清除DDPH自由基的能力表現(xiàn)為G2＞G1＞G3，其中G2組分清除率達到96.71%，具有較高的抗氧化能力。

2.8 羊肚菌抗氧化多肽G2組分LC-MS-MS鑒定

如圖8所示，根據(jù)LC-MS-MS鑒定，得到G2有效成分為單個寡肽，肽段質(zhì)量為779.433，其氨基酸序列為 FPLIPGH，即苯丙氨酸（Phe）- 脯氨酸（Pro）-亮氨酸（Leu）-異亮氨酸（Ile）-脯氨酸（Pro）-甘氨酸（Gly）- 組氨酸（His）。

3 結(jié)論

本試驗對超聲輔助酶解制備羊肚菌抗氧化多肽工藝進行研究，探討了復(fù)合酶配比、超聲功率、加酶量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、反應(yīng)pH對羊肚菌抗氧化肽制備的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析法進行優(yōu)化，最終確定了最優(yōu)條件為：酶解時間60 min、酶解溫度55.69℃、酶解pH值7.95，加酶量4 000 U/g。通過該方案制備的羊肚菌多肽DPPH自由基清除率達到89.09%。將所得多肽經(jīng)過超濾、DEAE-32、Sephadex G-25 進行分離純化，最終篩選到DPPH自由基清除率最高的多肽組分，其清除率達到96.71%。經(jīng)LC-MS-MS鑒定，該組分多肽氨基酸序列為FPLIPGH，其具有很高的研究價值，可以為功能食品開發(fā)和化妝品開發(fā)領(lǐng)域提供數(shù)據(jù)參考和支持。