芽孢桿菌菌株TYF-B5-5的產乙醇特性及其全基因組測序分析

郭宴君，樊璐璐，何永吉，郭春絨，范曉軍

（1.山西農業大學文理學院，山西太谷030801；2.太原理工大學環境科學與工程學院，山西太原030024；3.山西省農業科學院農產品加工研究所，山西太原030031）

在自然界中，木質纖維素的含量非常豐富，作為可再生資源，它廣泛存在于蔬果廢物、木材木屑、紙漿廢物及草本作物中。據報道，我國每年約產玉米秸稈7億t[1]，而大多數玉米秸稈被焚燒，造成了嚴重的環境污染。乙醇是石油燃料的主要替代品之一，而用于發酵生產乙醇的原料中木質纖維素是最具有經濟效益的一種原材料[2-4]?？衫媚举|纖維素生產乙醇的細菌絕大部分都具有特殊性質，據報道，現有包括真菌、細菌在內的近200種微生物，可以降解木質纖維素[5-6]。韓如等[7]對嗜熱細菌直接轉化纖維素產乙醇進行了探究，結果得出，以玉米秸稈為底物時乙醇產量在250～300 mg/L；ZIABREVA等[8]提出，乙醇產率受pH值的影響極大，合適的pH值甚至可以提高6倍左右的乙醇產率。

嗜熱細菌存在的生物技術潛力，從各種底物生產乙醇的能力以及某些物種降解木質纖維素的能力越來越受到人們的關注[9]，在嗜熱細菌中，糖熱厭氧桿菌可以降解木質纖維素，并且適用于高產乙醇的研究，但早期就認識到缺乏基因組信息是研究的關鍵限制[10]。

本研究中菌株TYF-B5-5是太原理工大學分子生物學實驗室從山西老陳醋成品醋液中篩選分離出的1株耐高溫細菌，該實驗室報道了它的完整基因組。由于食醋生產工藝的特殊性，導致菌株TYFB5-5存在可降解木質纖維素的特性，具有廣泛的底物譜，且主要代謝產物為乙醇，可利用天然玉米秸稈發酵代謝。本研究通過培養基優化使乙醇產率達到最佳，并從基因組學的角度加以證明，結果將為學者更好地研究嗜熱菌降解木質纖維素提供途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

供試芽孢桿菌菌株實驗室編號為TYF-B5-5。

1.2 試劑與儀器設備

木糖、葡萄糖、木聚糖、微晶纖維素，生工生物工程（上海）股份有限公司；其他化學試劑均為分析純。TS-8S搖床，蘇州培英實驗設備有限公司；ZHJH-C1109B超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；氣相色譜儀，日本島津。

1.3 方法

1.3.1 菌種的分離鑒定與發酵條件確定 使用MRS固體培養基對成品醋樣進行初篩，隨后挑取單菌落用加入乙醇的液體培養基復篩。使用基因組提取試劑盒（TIANGEN）提取菌株TYF-B5-5的基因組，用通用引物27F、533R和1492R進行擴增（表1），其產物進行Sanger測序，用NCBI網站對測序產物進行Blast同源比對，查找與菌株TYF-B5-5的16SrRNA相似度較高的物種。

表1 菌株TYF-B5-5的16S rRNA擴增引物

種子液擴大培養基。MRS（蛋白胨10g/L，酵母粉4g/L，牛肉粉8g/L，葡萄糖20 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，檸檬酸氫二銨 2 g/L，乙酸鈉 5 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，MnSO4·H2O 0.19 g/L，吐溫 -80 1 mL/L）液體培養基，置于燒瓶培養。菌種于MRS固體培養基保藏，對斜面上保存菌種進行適量挑取，用于菌種復蘇，在5 mL試管37℃、200 r/min過夜培養；隨后，將其倒入裝有50 mLMRS的培養基中進行擴大培養，所得的種子培養物接于發酵培養基中，并在37℃、200 r/min下培養。

1.3.2 發酵代謝物分析及產物優化 通過常規的紫外分光光度計在600 nm（OD600）處測量光密度來檢測細胞密度。乙醇的濃度測定通過備有Agilent HP-FFAP氣相色譜柱的日本島津氣相色譜儀進行檢測，乙醇濃度通過內標法計算，程序設定參照董曉亞等[11]的方法進行，進樣量1 μL，所有樣品均于12 000×g、10 min下離心，并通過孔徑為0.22 μm的過濾器。

在MRS培養基基礎上，將葡萄糖分別換為20g/L半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、D-木糖、秸稈、微晶纖維素以及木質素，用作優化發酵培養基的基本培養基。在溫度35～60℃，pH值4.5～8.5內培養36 h后取樣以進行乙醇優化。

1.4 全基因組數據處理分析

經電泳檢測合格的DNA樣品可進行后續的文庫制備，庫檢合格后采用Illumina HiSeq 2000測序平臺進行測序?；蚪M信息分析流程如圖1所示。

為保證信息的準確可靠，將獲得的原始數據進行過濾處理，得到有效數據。使用組裝軟件對Clean Data進行基因組組裝[12-16]，最終組裝結果與GO[17]、KEGG[18-19]、NR[20]等數據庫進行比對分析，完成基因注釋信息預測及功能預測。使用GeneMarkS（Version 4.17）[21]（http：//topaz.gatech.edu/GeneMark/）軟件對新測序的基因組進行編碼基因預測，分別通 過 RepeatMasker（Version open-4.0.5）軟 件[22]、tR NAscan-SE 軟 件[23]、IslandPath-DIOMB 軟 件[24]和phiSpy軟件進行重復序列[25]、非編碼RNA、基因島和前噬菌體預測。

2 結果與分析

2.1 菌種的分離鑒定

挑取MRS固體培養基中的單菌落，在加入乙醇的液體培養基中37℃培養12 h后，得到乙醇耐受菌株TYF-B5-5，將菌株TYF-B5-5的16S rRNA在NCBI網站進行Blast同源比對，結果顯示，菌株TYF-B5-5與已知菌屬Bacillussp.相似度最高，最高相似度可達99.80%，在同一屬名下相似度最高的種名為licheniformis。

2.2 菌株代謝產物分析及乙醇條件優化

2.2.1 代謝產物分析 由圖2-A菌株TYF-B5-5的氣相結果中可以看出，菌株TYF-B5-5在以葡萄糖為碳源時，它的主要代謝產物為乙醇；其次是3-羥基-2-丁酮、丙酮等，與其他代謝產物相比，乙醇含量遠高出2倍甚至更多，具體產物如表2所示。作為菌株TYF-B5-5的第二大代謝產物3-羥基-2-丁酮，是乙偶姻的化學名稱，乙偶姻是一種重要的食用香料，并且在功能材料、醫藥生產和化學方面具有廣泛的應用，用微生物法生產乙偶姻已成為現階段最受關注的方法。

表2 菌株TYF-B5-5產物GC-MS分析結果

2.2.2 乙醇特性優化 在MRS培養基基礎上，只改變其中碳源，用不同種類碳源代替，從圖3-a中可以看出，菌株除可利用葡萄糖外，在木質纖維素的利用上也展現出優勢，其在以天然玉米秸稈為底物時，乙醇濃度達到5.8 mmol/L；在此基礎上，改變發酵溫度及pH，如圖3-b顯示，在溫度為45℃時，乙醇產率最大，乙醇濃度達7.1 mmol/L，在改變溫度時發現，菌株TYF-B5-5在35～60℃內都可進行生長代謝，說明菌株TYF-B5-5為嗜熱菌；并且通過改變pH結果表明（圖3-c），當pH值達到7.0時，此時乙醇產率比其他pH值下明顯提高，乙醇濃度達8.0 mmol/L。因此，在以秸稈為碳源時，溫度45℃、pH值7.0時，乙醇產率最大，乙醇濃度達8.0mmol/L。

2.3 菌株全基因組測序及乙醇代謝通路預測

2.3.1 樣品組裝結果 菌株TYF-B5-5共有11個scafflods和12個contings，其中，contingN50和contingN90大小分別為 2 063 254、290 635 bp；GC含量為43.56%，總共有4303個基因，平均長度為826bp，包括78個tRNA和15個sRNA（表3）。

表3 菌株TYF-B5-5的基因組統計

2.3.2 基因功能注釋 菌株TYF-B5-5在NR、KEGG和COG數據庫中得到注釋的基因最多，分別為4245、4179、3107個，分別占基因總數的96.32%、94.83%、70.5%；而TCDB數據庫中注釋到的基因最少，為546個，占基因總數的12.39%（圖4）。

NR數據庫顯示，菌株TYF-B5-5在屬水平上與芽孢桿菌屬（Bacillussp.）核酸序列相似度最高，為58.08%；在種水平上與芽孢桿菌（Bacillus subtilis）相似度最高，為32.07%。KEGG數據庫分析得出，在代謝通路上，萜類和聚酮化合物的代謝最多，668個基因被注釋；其次，是碳水化合物代謝（261個）。GO數據庫中整體分3類功能注釋結果，其中包括46種細分結果，在細胞過程和代謝過程功能表現最高相關性，分別有1 578、1 574個基因。從TCDB數據庫一級分類看，基因組的主動轉運蛋白及電化學勢驅動轉運子基因最多，分別為196、202個；從二級分類看，與轉運及P-P磷酸化驅動轉運蛋白的數目最多，分別為202、178個。

將菌株TYF-B5-5的氨基酸序列在COG數據庫中進行比對，得到相應的基因組功能的注釋，結果顯示（圖5），具有通用功能的基因種類最多，為347個；其次是具有轉錄功能的基因，共322個注釋結果。與碳水化合物的運輸和代謝相關的基因也展現出優勢，314個基因被注釋；此外發現，有233個功能未知的基因，還有待今后深入研究。

2.3.3 乙醇代謝通路預測 在KEGG數據結果中，發現PDH（丙酮酸脫氫酶）、ALDH（乙醛脫氫酶）、ADH（乙醇脫氫酶）、PTA（磷酸轉乙酰酶）、AK（乙酸激酶）被注釋并進行了功能預測。而根據乙醇代謝通路得知（圖6），這5種酶為代謝途徑中的關鍵酶，因此，我們推測菌株TYF-B5-5是通過此路徑得到代謝產物乙醇，菌株產乙醇特性從分子生物學角度得到證明。

3 結論與討論

本試驗主要針對山西農業大學分子生物學實驗室新篩菌株TYF-B5-5進行的一系列研究，根據GC-MS對代謝產物進行分析，結果發現，其主要代謝產物為乙醇，并且具有廣泛的底物譜，如木質纖維素等。雖然產乙醇菌屬較多，包括芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等，但仍有部分屬內物種的生理學和產乙醇潛力未得到廣泛研究，為了了解菌株TFY-B5-5的更多特性，進行了全基因組測序分析，確定菌株基因組大小為3 984 415 bp，GC含量為43.56%。通過在KEGG數據庫相關基因的功能預測，從分子生物學角度證明菌株產乙醇特性。為今后深入探究分解木質纖維素嗜熱枯草芽孢桿菌的代謝功能及生物學特性研究提供了參考。

菌株TYF-B5-5可以利用未經處理的玉米秸稈一步發酵生產乙醇，為我國農業資源利用提供了技術方法。我們參考已有的丙酮酸到乙醇的代謝途徑，通過基因組注釋信息推斷出菌株TYF-B5-5的乙醇代謝通路以及旁路基因PTA等的存在，可能是導致乙醇產率下降的重要原因；接下來可通過熒光定量PCR、基因敲除等方法進一步研究相關基因，使菌株得到工業化應用。在GC-MS結果中發現，除乙醇外，產物中有3-羥基-2-丁酮，說明菌株TYFB5-5具有其他應用價值，值得后期深入研究。

呂福英等[27]研究指出，嗜熱富集物在pH值為7.5、以麥稈為唯一碳源時，乙醇產量為0.129 g/L（2.8 mmol/L），而本研究菌株TYF-B5-5比其高出2倍多，且是單菌發酵，可能是由于食醋在生產過程中的特殊性，導致菌株TYF-B5-5既耐高溫又能利用秸稈為碳源生產乙醇。其還有待于進一步研究。