福州地區(qū)柑橘種質(zhì)資源的ISSR分析

趙依杰 林麗霞 姚立萍 駱志堅 胡章瓊

摘要：研究利用ISSR（inter-simple sequence repeat）分子標記技術(shù)對21份福州地區(qū)柑橘種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，以期為福州地區(qū)柑橘的品種鑒定及育種提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。試驗從27條ISSR引物中篩選出多態(tài)性好、條帶清晰的14條引物，對供試材料進行遺傳多態(tài)性分析。獲得162條總條帶，其中多態(tài)性條帶129條，多態(tài)位點百分率為79.63%;聚類結(jié)果顯示21份資源可分為5個組，13份福橘被聚為同一組，進而可劃分為4個亞組。ISSR標記能較好地區(qū)分福州地區(qū)柑橘資源，且福州柑橘地方資源遺傳多樣性豐富。

關(guān)鍵詞：柑橘;種質(zhì)資源;福州;ISSR分子標記;遺傳多樣性

中圖分類號：S666.2

文獻標志碼：A

論文編號：cjas18080021

0引言

柑橘（Citrus reticulata）是蕓香科屬植物[1]，喜溫暖濕潤氣候。一般適合在12.5-37℃的溫度下生長發(fā)育，也與日照、水分、土壤以及海拔等環(huán)境條件緊密相關(guān)。柑橘栽培歷史悠久，色彩絢麗的柑橘全身都是寶，不僅有很高的食用價值而且還具有藥用及保健功效[2-3]。不過，與其他果樹相比，柑橘易發(fā)生種間雜交及與其近緣枳屬、金柑屬之間的雜交，還受到芽變、環(huán)境及栽培方式等影響，以致發(fā)生了遺傳變異而擁有眾多遺傳資源[4]。福州位于歐亞大陸東南邊緣，東臨太平洋，是典型的亞熱帶濕潤季風氣候，年平均降水量900-2100mm，年平均氣溫16-20℃，海拔多在600-1000m之間。因此，氣溫適宜和雨水充足的福州適合柑橘的廣泛種植及新品種的培育。但是，福州地區(qū)柑橘品種鑒定及其研發(fā)利用仍處于滯后階段，研究其種質(zhì)資源遺傳多樣性對遺傳改良和優(yōu)異種質(zhì)資源保護具有重要意義。目前，已有較多關(guān)于柑橘遺傳多樣性的研究報道，但鮮有針對福州地區(qū)柑橘資源的評價研究[5-7]。本研究利用ISSR分子標記技術(shù)對福州地區(qū)的部分柑橘種質(zhì)資源進行遺傳多樣性及親緣關(guān)系評價，以期為福州地區(qū)柑橘種質(zhì)資源的創(chuàng)新、研發(fā)利用及保護提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

21份柑橘種質(zhì)資源采自福州市農(nóng)業(yè)科學研究所柑橘種質(zhì)資源圃（表1）。選取新生幼嫩、無病害葉片置于錫箔紙中，液氮速凍后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｔ囼炛兴迷噭┧幤肪杀本┤浇鹕锛夹g(shù)有限公司提供。

1.2DNA的提取與純化

選取健康幼嫩的柑橘葉片，參考改良過的CTAB-mini法[8]提取葉片基因組DNA，測定其純度，用1%瓊脂凝膠電泳檢測DNA，并用紫外分光光度計測定濃度與純度質(zhì)量。最終將DNA稀釋到25ng/μL，于-20CC冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3ISSR反應條件建立及引物篩選

通過對基因組DNA濃度、TaqDNA聚合酶、引物、Mg2+、dNTP、退火溫度等主要因素的調(diào)整、優(yōu)化，確定ISSR-PCR擴增反應總體積為20μL，PCR反應液含有的組分和終濃度為：DNA模板1μL（20ng/μL），引物1μL（10μmol/L），2×Easy Taq PCR SuperMix 10μL，ddH2O8μL。

實驗根據(jù)加拿大溫哥華哥倫比亞大學ISSR引物庫數(shù)據(jù)，查閱文獻選取27條引物，并委托福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成。在引物篩選中，以隨機挑選的5個樣品的DNA為模版進行ISSR-PCR擴增，最終挑選出14條引物。

1.4ISSR擴增及產(chǎn)物檢測

擴增反應在PCR擴增儀上進行，擴增程序為：94℃預變性3min，94℃變性30s，最適退火溫度下退火1min（退火溫度隨引物而定），72℃延伸1min，經(jīng)過35個循環(huán)后，72℃延伸10min。

擴增產(chǎn)物檢測：以Trans2K Plus DNA Mark為分子量標記，在0.5xTBE緩沖液中，于2%瓊脂糖凝膠，90V電壓下電泳50min，用Britain GGM/D2凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.5統(tǒng)計學處理

對各居群ISSR-PCR產(chǎn)物的電泳圖譜進行判讀，每個電泳圖譜中同一擴增位點上有條帶記作“1”，無條帶記作“0”，得到由“1”和“0”組成的二元式數(shù)據(jù)矩陣[9]。運用NTSYS-pc2.1Oe軟件的Dice方法計算遺傳相似系數(shù)，用UPGMA法進行聚類分析，建立聚類分析樹狀圖[10]。

2結(jié)果與分析

2.1引物篩選

從27條ISSR引物中篩選出14條擴增條帶清晰、多態(tài)性高且重復性好的引物，編號依次為Z810、Z825、Z807、Z834、Z840、Z855、Z873、Z809、Z826、Z842、Z847、Z848、Z867、Z881，用于21個樣本的遺傳多樣性分析。圖1為引物對柑橘15個樣本總DNA進行ISSR擴增的瓊脂糖電泳圖譜。

2.2ISSR擴增結(jié)果

篩選的14條引物共擴增出清晰可重復的條帶162條，平均為11.57條，擴增產(chǎn)物主要介于250-3000bp，擴增條帶數(shù)最少和最多的引物分別是Z848、Z881，各擴增出7條和17條條帶。其中多態(tài)條帶129條，平均多態(tài)位點百分率占79.63%;多態(tài)性最低的引物是Z842，多態(tài)性為60%;多態(tài)性最高的引物是Z825，多態(tài)性高達100%。

2.3 21份福州地區(qū)柑橘的群體結(jié)構(gòu)分析（基于距離聚類）

采用NTSYSpc2.le軟件根據(jù)Nei's遺傳一致度，利用非加權(quán)配對算數(shù)平均法（unweighted pair groupmethod using arithmetic average，UPGMA），對供試的21份柑橘個體進行遺傳關(guān)系聚類，得到福州柑橘聚類樹狀圖（圖2）。如圖所示，當以遺傳相似系數(shù)0.72為閡值，可將供試的21份材料劃分為5組（A、B、C、D、E）。A組包含5份資源，在組中‘日輝、‘紅皮桔相聚，‘魯賓諾、‘托馬特拉相聚，再與‘秋輝聚類，說明‘日輝與‘紅皮桔親緣關(guān)系較近，‘魯賓諾與‘托馬特拉親緣關(guān)系較近。當以遺傳相似系數(shù)0.80為閾值，A組又可分為3個亞組，‘日輝與‘紅皮桔、‘魯賓諾與‘托馬特拉依然聚類為一組，而‘秋輝獨立一組，這說明‘秋輝與‘魯賓諾、‘托馬特拉的親緣關(guān)系相對較遠。B組包含13份資源，具體為‘閩清2號、‘閩清新1、‘東岱、‘閩清1號、‘珠心胚1號、‘珠心胚2號、‘閩侯大義、‘江南橫槎、‘砂糖橘、‘蘆柑、‘溫州蜜桔、‘新余蜜桔和‘日本桔，且這13份柑橘種質(zhì)資源都為福橘并存在一定的親緣關(guān)系。當以遺傳相似系數(shù)0.80為閾值，可將B組資源分成為4個亞組。B1‘閩清2號、‘閩清新1、‘東岱、‘閩清1號、‘珠心胚1號、‘珠心胚2號、‘閩侯大義、‘江南橫槎;B2‘砂糖橘、‘蘆柑;B3‘溫州蜜桔、‘新余蜜桔;B4‘日本桔。說明亞組內(nèi)各資源可能存在相對密切的親緣關(guān)系。C組為‘黃果柑單獨成組，為柑類;D組為‘黑納蒂娜單獨成組，為雜柑類;E組為‘桔柚單獨成組，為桔柚類。

3結(jié)論與討論

在柑橘親緣關(guān)系及遺傳多樣性分析方面，已采用RAPD、AFLP、SSR、ISSR等分子標記技術(shù)進行研究[5-7.11-15]。王三紅等[16]應用RAPD技術(shù)對臍橙品系和葡萄柚品系進行鑒別;謝讓金等[17]利用AFLP分子標記對真正柑橘果樹群6屬植物間以及柑橘屬各主要類型（種）的進化關(guān)系進行了詳細的討論;辜青青等[18]利用SSR標記技術(shù)對28份南豐柑橘資源進行基因組多態(tài)性分析，他們發(fā)現(xiàn)南豐廣橘品種群中‘蜜廣與南豐蜜橘品種群親緣關(guān)系較近，而‘紅廣與親本南豐蜜橘和‘紅橘的親緣關(guān)系均較遠;施維屬等[19]運用ISSR分子標記法發(fā)現(xiàn)24份甜橙種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系相對較近，并找到了鑒定不同品種的特異性標記。

ISSR既綜合了RFLP、RAPD及SSR等分子標記技術(shù)的各種優(yōu)點，又具有較高的多態(tài)性和穩(wěn)定性，無需預知物種DNA信息背景，操作簡單，成本低，廣泛應用于植物的遺傳多樣性研究[11.20-22]。因此，本研究采用ISSR分子標記技術(shù)，并通過篩選得到14對高效ISSR引物對21份樣品進行遺傳多樣性分析，共檢測到位點162個，多態(tài)率高達79.63%，多態(tài)性較高，表明供試柑橘基因組DNA具有明顯的遺傳差異，具有較高的遺傳多樣性。此次試驗所選的21份柑橘種質(zhì)資源均采自福州地區(qū)，其中13份柑橘種質(zhì)資源為福橘，意在探究福橘與其他引進品種之間的親緣關(guān)系，以便對地方特色柑橘種質(zhì)資源進行更好地保護和遺傳改良。因柑橘葉片中富含酚類、單寧及多糖等干擾物質(zhì)增加了基因組提取難度，施維屬等[8]采用液氮下研磨柑橘葉片進行DNA提取。傳統(tǒng)的酚-氯仿提取操作繁瑣且有毒，而本研究所用的磁珠法核酸提取技術(shù)操作簡單、毒性低且可多個樣品同時提取，效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方式。

遺傳一致度是從相同的方向?qū)┰嚨母涕龠M行遺傳關(guān)系方面的分析，親緣關(guān)系越近的柑橘遺傳一致度系數(shù)越接近[23-25]。根據(jù)ISSR分子標記技術(shù)所產(chǎn)生的“1”、“0”矩陣數(shù)據(jù)，并利用NTSYSpc2.1軟件根據(jù)Nei's遺傳一致度，利用UPGMA法對福州21份柑橘種質(zhì)資源進行聚類與分析，由圖2分析，供試柑橘之間的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.64-0.96。遺傳相似系數(shù)在0.64處，21份柑橘資源可以分成2類，即桔柚類和余下20份柑橘資源聚成1類。當以遺傳相似系數(shù)0.72為閾值可將供試的21份材料劃分為5組。聚類分析結(jié)果顯示同一類別的柑橘種質(zhì)資源遺傳關(guān)系較近，往往劃分在同一組。本研究表明ISSR可有效揭示福州種質(zhì)資源的遺傳多樣性、親緣關(guān)系和遺傳分化程度，為探討福州地區(qū)柑橘的適應性和生存力提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，能夠及時為瀕危品種制定科學有效的保護方案并采取相應的措施。

4問題與展望

利用ISSR分子標記技術(shù)能有效地鑒定柑橘不同品種及分析種質(zhì)資源的遺傳多樣性，但所需引物需要具有更強的專一性，為此在篩選引物時增加了試驗工作量;同時，需要一定時間摸索PCR擴增的最適反應條件;此外，ISSR分子標記呈顯性遺傳標記，不能區(qū)分顯性純合基因型和雜合基因型[26]。在計算遺傳相似系數(shù)時可能存在無法避免的偏差，有些長度剛好相等的條帶出現(xiàn)在同一個位置上，但并不一定來自基因組上的同一區(qū)域。因此，對柑橘分類的研究應該考慮各方面的影響因素綜合分析。今后柑橘遺傳圖譜研究中，可利用ISSR標記和其他分子標記技術(shù)聯(lián)合來共同構(gòu)建，并可利用與目標質(zhì)量性狀基因緊密連鎖的分子標記進行質(zhì)量性狀選擇，如抗病性、抗蟲性和抗鹽性等。同時，充分利用ISSR分子標記進行柑橘種質(zhì)資源的鑒定及新種質(zhì)的創(chuàng)新，還應注重分子標記與豐富的傳統(tǒng)育種經(jīng)驗相結(jié)合，提高柑橘在農(nóng)產(chǎn)品市場上的競爭力。

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基金項目：福建省科技計劃項目“福桔種質(zhì)資源的收集、保存、利用和創(chuàng)新”（2017N0060），“都市特色園藝作物種質(zhì)資源保護與創(chuàng)新利用”（2016N3018）。

第一作者簡介：趙依杰，男，1970年出生，福建長樂人，研究員，碩士，研究方向：瓜果品種選育與栽培生理。通信地址：350018福州市倉山區(qū)城門石步275號福州市農(nóng)業(yè)科學研究所，Tel：0591-83508677，E-mail：zyjie1970@163.com。

通訊作者：胡章瓊，女，1974年出生，湖北公安人，副研究員，研究方向：果樹栽培與育種。通信地址：350018福州市倉山區(qū)城門石步275號福州市農(nóng)業(yè)科學研究所，Tel：0591-83508677，E-mail：549392473@qq.com。

收稿日期：2018-08-23，修回日期：2019-02-26。