響應(yīng)面法優(yōu)化梔子中梔子苷的純化工藝

陳 婕，鄧愛華，劉 聃，劉康珂，柏珊珊，段艷輝，黃 穎，王 志

（1.湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南常德 415000；2.湖南文理學(xué)院芙蓉學(xué)院，湖南常德 415000；3.澧縣扶農(nóng)中藥材農(nóng)民專業(yè)合作社，湖南常德 415000）

梔子（Gardenia jasminoides Ellis） 中梔子苷含量可達(dá)10.4 mg/g[1]，其廣泛用于改善睡眠[2]、清熱瀉火[3]、保肝利膽[4]等藥物的開發(fā)。試驗(yàn)通過響應(yīng)面法優(yōu)化正丁醇萃取法純化梔子苷的影響因素，并對(duì)各個(gè)因素的顯著性及交互作用進(jìn)行分析，以期為梔子中梔子苷的工業(yè)化分離提供理論依據(jù)和生產(chǎn)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梔子果，澧縣扶農(nóng)中藥材農(nóng)民專業(yè)合作社提供；梔子苷標(biāo)準(zhǔn)品，北京盛世康普化工技術(shù)研究院提供；甲醇（AR）、正丁醇（AR），湖南匯虹試劑有限公司提供。

PHS-25型pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；TDL-40B型高速離心機(jī)，上海安寧科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；RE52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；UV-1800型紫外分光光度計(jì)，長沙市天恒儀器有限公司產(chǎn)品；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；HJ-6型磁力加熱攪拌器，金壇市城東新瑞儀器廠產(chǎn)品；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

稱取梔子干果適量，粉碎過40目篩，石油醚脫脂，按料液比1∶20加入50%甲醇水溶液，在超聲頻率40 kHz，超聲功率150 W下提取30 min，浸提3次，合并濾液過濾、真空濃縮得到梔子浸膏。取梔子浸膏溶于水配置不同濃度的梔子苷水溶液，再加入一定比例的正丁醇，萃取一定的時(shí)間后靜置分相，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)梔子苷的萃取率。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 梔子苷標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密稱取15 mg梔子苷標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容至100 mL，配制0.15 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液。分別吸取0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL母液，加入甲醇定容至50 mL，得到 1.5，3.0，6.0，12.0，18.0，24.0 μg/mL梔子苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。以甲醇為空白對(duì)照，在波長238 nm處測(cè)吸光度。以梔子苷標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（C）、吸光度為縱坐標(biāo)（A），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得梔子苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.0173C+0.13，R2=0.999 9，R2接近于1，結(jié)果表明梔子苷質(zhì)量濃度在 1.5～24.0 μg/mL線性關(guān)系良好。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

配制一定質(zhì)量濃度的梔子苷水溶液，加入正丁醇萃取。分別考查萃取時(shí)間（10，20，30，40，50 min）、萃取溫度（15，25，35，45，55℃）、梔子苷質(zhì)量濃度（2，4，6，8，10 mg/mL）、正丁醇/水溶液體積比 （0.50∶1，0.75∶1，1.00∶1，1.25∶1，1.50∶1）、pH 值 （3.0，5.0，7.0，9.0，11.0） 等對(duì)梔子苷萃取率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選取萃取溫度、梔子苷質(zhì)量濃度、正丁醇/水溶液體積比為考查因素，以梔子苷萃取率為響應(yīng)值，運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。

響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 萃取時(shí)間對(duì)萃取率的影響

萃取時(shí)間對(duì)萃取率的影響見圖1。

圖1 萃取時(shí)間對(duì)萃取率的影響

由圖1可知，萃取率隨萃取時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。隨著萃取時(shí)間的增加，梔子苷逐漸富集到有機(jī)相中，梔子苷的萃取率不斷增大。由于正丁醇在上相易揮發(fā)，如萃取時(shí)間進(jìn)一步延長，正丁醇體積減少，更多雜質(zhì)進(jìn)入正丁醇相，導(dǎo)致梔子苷萃取率下降，選擇萃取時(shí)間為30 min。

2.1.2 萃取溫度對(duì)萃取率的影響

萃取溫度對(duì)萃取率的影響見圖2。

圖2 萃取溫度對(duì)萃取率的影響

由圖2可知，萃取率隨萃取溫度增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。萃取溫度的增加會(huì)提高溶質(zhì)的傳質(zhì)效率，提高萃取率，同時(shí)也會(huì)加快正丁醇的揮發(fā)速度，降低正丁醇量，選擇萃取溫度為45℃。

2.1.3 梔子苷質(zhì)量濃度對(duì)萃取率的影響

梔子苷質(zhì)量濃度對(duì)萃取率的影響見圖3。

圖3 梔子苷質(zhì)量濃度對(duì)萃取率的影響

由圖3可知，隨著梔子苷質(zhì)量濃度增大，梔子苷萃取率增加。當(dāng)正丁醇相中溶解的梔子苷達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí)，繼續(xù)增加梔子苷質(zhì)量濃度，反而導(dǎo)致萃取率下降，選擇梔子苷質(zhì)量濃度為4 mg/mL。

2.1.4 相比對(duì)萃取率的影響

相比對(duì)萃取率的影響見圖4。

圖4 相比對(duì)萃取率的影響

由圖4可知，隨著正丁醇/梔子水溶液體積比的增加，萃取率先增加后降低。正丁醇質(zhì)量濃度的增加，體系的極性發(fā)生改變，根據(jù)相似相溶原理，梔子苷萃取率在一定范圍內(nèi)增加，選擇相比為0.5∶1。

2.1.5 pH值對(duì)萃取率的影響

pH值對(duì)萃取率的影響見圖5。

圖5 pH值對(duì)萃取率的影響

由圖5可知，隨著pH值的增大，萃取率緩慢下降，但整體影響不明顯。為了減少雜質(zhì)離子的引入，選擇pH值為7.0。

2.2 Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，回歸方程顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

使用Design Expert 8.0.6對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程方差分析結(jié)果表3。對(duì)結(jié)果進(jìn)行二次回歸擬合后，得相比（A）、萃取溫度（B）和梔子苷質(zhì)量濃度（C）對(duì)梔子苷萃取率的二次多項(xiàng)回歸方程：

表3 回歸方程顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

方差分析顯示模型顯著（p＜0.05），失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），因此模型成立。從表3可知，一次項(xiàng)C、交互相AC及二次項(xiàng)A2，B2，C2對(duì)萃取率的影響非常顯著（p＜0.001）；交互相AB、BC對(duì)萃取率的影響極顯著（p＜0.01）；一次項(xiàng)A，B對(duì)萃取率的影響顯著（p＜0.05）；由F值可知，在所選試驗(yàn)范圍內(nèi)，A（相比）、B（萃取溫度）和C（梔子苷質(zhì)量濃度）對(duì)萃取率的影響順序?yàn)镃（梔子苷質(zhì)量濃度） ＞ A（相比） ＞B（萃取溫度）。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

交互作用對(duì)萃取率影響響應(yīng)面圖見圖6。

對(duì)比曲面陡峭程度，發(fā)現(xiàn)與方差分析結(jié)果一致，梔子苷質(zhì)量濃度與相比之間存在非常顯著的交互作用，相比與萃取溫度、萃取溫度與梔子苷質(zhì)量濃度之間存在顯著的交互作用。

2.4 最優(yōu)萃取工藝條件的確定

利用Design Expert 8.0.6軟件由所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)分析，得出最佳萃取工藝條件為萃取時(shí)間30 min，萃取溫度45.93℃，梔子苷質(zhì)量濃度2.68 mg/mL，相比0.398∶1，pH值7.0，預(yù)測(cè)梔子苷萃取率為30.18%。為了適合實(shí)際操作，調(diào)整條件萃取時(shí)間30 min，萃取溫度45℃，梔子苷質(zhì)量濃度3.0 mg/mL，相比0.5∶1，pH值7.0，通過3組平行試驗(yàn)，梔子苷萃取率平均值為30.27%±0.08%，與預(yù)測(cè)值無顯著性差異（p＞0.05）。證明此條件為梔子苷萃取的最優(yōu)條件，該回歸方程可用于實(shí)踐。

3 結(jié)論

以脫脂及甲醇超聲提取獲得梔子提取物為原料，經(jīng)正丁醇萃取富集梔子苷。通過響應(yīng)面法獲得最優(yōu)萃取工藝參數(shù)為萃取時(shí)間30 min，萃取溫度45℃，梔子苷質(zhì)量濃度3.0 mg/mL，相比0.5∶1，pH值7.0，在此條件下，梔子苷萃取率為30.27%，與預(yù)測(cè)值30.18%無顯著性差異（p＞0.05）。通過正丁醇萃取富集梔子醇提取物中梔子苷，將為梔子的開發(fā)利用提供技術(shù)參考。