質譜技術在缺血性中風標志物發現中的應用及進展

王健瑩，吳 茜，姚鐘平*

(1.香港理工大學 化學生物學及藥物研發國家重點實驗室，食物安全及科技研究中心，應用生物與化學科技學系，香港；2.香港理工大學深圳研究院 深圳市中藥藥學及分子藥理學研究重點實驗室(國家重點實驗室培育基地)，深圳市食品生物污染與控制重點實驗室，廣東 深圳 518057)

腦卒中是嚴重威脅人類健康的重要疾病，具有高致殘率和高死亡率的特點。腦卒中包括出血性中風(ICH)和缺血性中風(IS)，其中，IS占比高達87%[1-2]。根據發病原因，IS又分為大動脈粥樣硬化性卒中、小動脈卒中、心源性腦栓塞以及未知病因IS。組織性纖溶酶原激活劑(rtPA)是目前美國食品藥品監督管理局(FDA)批準的唯一用于急性IS溶栓的藥物，然而靜脈注射rtPA的最佳治療窗為發病后3 或 4.5 h內，一旦錯過該黃金時間，不僅預后不佳，而且出血性轉化的概率大幅提高[2]。所以，IS的早期預防、診斷、治療以及預后的功能評估成為降低IS致死率和致殘率的關鍵。目前，腦梗死的診斷主要依據臨床表現及神經影像技術，輔以神經血管成像數據或計算機斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)、超聲檢查或血管造影。這些成像技術已被用于區分缺血性和出血性中風，并排除卒中假象。對于急性缺血性卒中診斷，目前這些臨床常用方法因在靈敏度、準確度及耗時方面尚存在不足[3]，有時會產生誤診或者漏診，從而可能導致治療延誤及增加復發中風的風險。尋找分子標志物以快速且準確診斷和區分缺血性中風，是解決這些問題的有效方法。

質譜技術不僅靈敏度高、分析速度快、無需標記、可同時檢測多組分，還能獲得分子的結構信息，在組學領域已逐漸成為主要分析手段。液相色譜-質譜和氣相色譜-質譜聯用技術可以在質譜分析前進行色譜分離，有助于生物樣本中復雜成分的結構鑒定和定量分析，因此廣泛應用于標志物的發現[4]。此外，基質輔助激光解吸電離(MALDI)飛行時間質譜成像技術可直接分析生物組織切片樣本，對組織中化合物的組成、相對豐度及分布情況進行高通量、全面、快速分析，在生物標志物的發現中具有廣泛的應用。近年來，質譜技術被越來越多的學者用以進行腦梗死相關標志物的發現，在腦梗死的超早期診斷、病因學分型、預后評估、鑒別診斷以及二級預防等方面發揮著越來越重要的作用。與IS相關的分子標志物主要為蛋白質以及小分子代謝物，以下將對質譜技術在這兩類標志物發現中的應用進行綜述及展望。

1 蛋白質標志物

腦損傷發生后的腦細胞狀態與蛋白質表達密切相關，因此蛋白質標志物篩選對中風的快速診治有著積極、重要的作用，并且有些已經進入臨床實驗[5-7]。近年來高通量的蛋白質組學技術在評估神經元損傷程度，研究藥物作用機制以及尋找關鍵蛋白標志物等方面的作用日益明顯[7]。基于質譜分析的蛋白組學使得獲得高精度的大量譜學數據成為可能，在中風標志物發現方面有不可替代的優勢。

1.1 缺血性中風標志物

與腦組織、腦脊液相比，血液或者血漿樣品中標志物含量相對較低，但是因為侵入性小，容易獲取，并且直接與循環系統相關聯而在臨床上有著重要的價值[7]。而血液標志物在中風的診斷、預測中風后腦損傷程度、中風復發以及愈后恢復進展等方面都有一定相關性[9-10]。Allard等[11]將表面增強激光解析(SELDI)技術應用于中風標志物研究，實驗組血漿樣品強陰離子交換SELDI譜顯示4種蛋白可以作為潛在的標志物，分別為載脂蛋白C1(ApoC-I)、載脂蛋白C-3(ApoC-Ⅲ)、血清淀粉樣蛋白與抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)，并通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)分析首次發現ApoC-I與ApoC-Ⅲ蛋白在缺血性中風與出血性中風患者間有顯著性差異。類似地，Lopez等[12]進一步以選擇離子監測(SIM)質譜分析方法對臨床患者血漿樣本中一組9個載脂蛋白進行定量分析，研究結果表明，結合ApoC-Ⅲ與ApoC-I兩種蛋白血漿濃度值，可以很好地鑒定缺血性中風與出血性中風，為之前研究結果提供了很好的驗證。George等[13]專注于短暫性腦缺血發作(TIA)的研究，以高分辨線性軌道阱質譜對TIA患者、小中風患者與對照組別的血清蛋白質組開展了分析，實驗中血清銅藍蛋白、補體成分8γ(C8γ)與血小板堿性蛋白在中風組與對照組間有顯著性差異，其中，血小板堿性蛋白被驗證可以列為TIA診斷的候選標志物。此外，在生物表型中有非常重要作用的金屬蛋白標志物，亦具有區分中風類別的能力。Kodali等[14]以電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)檢測不同中風類別的29個血漿樣品，發現鎂、錳、銅、硒相關的蛋白在類中風和缺血性中風，以及缺血性中風與出血性中風病人組間均有統計學差異；而鉛濃度在類中風和缺血性中風病人中有組間差異。

文獻[15]以質譜方法定量測定外周血單核細胞(PBMCs)中疊氮基丙氨酸標記的新生蛋白質組，結果發現新生蛋白和總蛋白組在中風組與正常對照組間均存在差異，而PBMC新生蛋白組改變更加明顯，可作為新的中風標記物篩選來源。此外，腦組織和腦脊液樣本可以直接針對中風發作前后的病灶部位、病程進展情況以及特定類別病例進行分析，其結果對于臨床診斷具有更重要的意義。Garcia等[16]采用基于質譜的蛋白質組學方法，在患者中風后受損傷部位腦區組織中鑒定到51個蛋白水平發生了變化，其中凝溶膠蛋白、二氫嘧啶酶相關蛋白2與胱抑素3種蛋白分子與中風后遺情況密切相關。結合激光捕獲微解剖技術，質譜技術可以實現對指定位點蛋白標記物的半定量測定。Lian等[17]發現在中腦動脈閉塞位點，包括輕肽神經絲蛋白(NEFL)、人互聯蛋白神經元中間絲蛋白α(INA)、微管相關蛋白2(MAP2)、髓磷脂堿性蛋白(MBP)、髓鞘蛋白脂質蛋白(PLP)和2′,3′-環核苷酸3′-磷酸二酯酶(CNP)在內的6種非可溶蛋白分布較為集中，而神經元特異性烯醇化酶(NSE)、泛素羧基末端水解酶-1(UCH-L1)、神經絲重鏈多肽(NEFH)、神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、微管相關蛋白Tau蛋白與Ⅲ型β微管蛋白(TUBB3)在腦組織中則是均勻分布的，此結果表明非可溶性蛋白可以作為位點相關性的標志物，具有進一步臨床研究潛力。同樣地，對腦脊液中蛋白質組的分析有助于找到中樞神經系統相關的標志物，對腦部疾病有很好的診斷意義，因而吸引了不少研究關注[18-19]。Dayon等[20]采用異構體多級質譜標記(TMT)定量方法對嚴重腦損傷死亡患者(PM)與臨死前患者(AM)腦脊液樣本中蛋白組進行比較，結果顯示PM組別樣本中鑒定到的78個蛋白含量明顯高于對照組，包括GFAP、S100B蛋白與帕金森氏病蛋白7等之前報道過的蛋白。

1.2 缺血性中風病因亞型標志物

卵圓孔未閉會導致血栓通過靜脈進入動脈循環，引起中風，此類患者往往有較高中風風險，而血管內封閉是常用的治療手段。白蛋白可以作為脂蛋白、小分子和藥物等的載體，具有重要生物活性并受到廣泛研究關注。為比較一般中風與卵圓孔未閉引起的中風組間，以及卵圓孔未閉中風患者與實施血管內封閉組別的差異，Lopze等[21-22]采用白蛋白免疫富集與高分辨多級質譜聯用的方式，特異性捕獲并定量血漿樣本白蛋白相關的蛋白質組，發現白蛋白相關蛋白質組研究可以成為有力的標志物發現手段，血管內封閉可以對高密度脂蛋白膽固醇及載脂蛋白A1豐度產生影響，對心血管功能提供保護。Rocchiccioli等[23]發現動脈粥樣硬化有較高的發病率和死亡率，而頸動脈斑塊破裂導致的急性中風約占缺血性中風的15%～20%，與組織整體蛋白組相比，斑塊分泌蛋白組學可以檢測到更有代表性的標志物。以非標記高分辨質譜方法對14個病人頸動脈內膜剝離樣本中的分泌蛋白組進行分析，發現血小板反應素-1、維生素D結合蛋白、黏著斑蛋白顯示出異常水平，經抗體活性驗證，前兩種蛋白在動脈粥樣硬化患者中有著明顯高表達。MALDI質譜成像技術是測定物質組織分布的強有力手段，對中腦動脈封閉模型小鼠腦組織出現梗塞部位切片與對側對照部位切片分別進行成像，發現13種物質含量在梗塞區域有顯著升高，鑒定結果表明ATP合成酶5I、細胞色素C氧化酶亞基VIc和人尿苷酸-胞苷酸激酶3種蛋白表達有所改變[24]。

2 小分子代謝物標志物

代謝產物位于生命活動的下游，能直接地反映組織的生化狀態。小分子代謝物比蛋白質更容易透過血腦屏障，而且與RNA和DNA比較，穩定性更好[25]，因此，代謝組學成為快速和全面分析卒中生物樣本的強有力手段。作為代謝組學研究常用的技術平臺，液相質譜和氣相質譜結合了色譜良好的分離能力和質譜的高靈敏度及高分辨率，可用于量化和鑒定復雜生物醫學樣本中低濃度代謝物。因此，利用質譜和代謝組學方法檢測患者代謝水平的差異，進而探索IS相關的生物標志物，可指導IS的預防、診斷和治療過程，并揭示中風的生理病理途徑。

2.1 缺血性中風標志物

Jiang等[26]利用UPLC-TOF MS分析了67名超急性卒中患者和62名健康受試者的血清樣本，發現卒中患者體內半胱氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、氧化性谷胱甘肽、羥基二十碳四烯酸和羥基十八碳二烯酸的濃度升高，而葉酸、四氫葉酸、腺苷、醛固酮、去氧喋呤、蔗糖-6-磷酸和甜菜堿水平顯著性降低，并建立了正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)模型預測中風的可能性。多項代謝組學研究表明，缺血性卒中患者血液中谷氨酸增加，賴氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、蛋氨酸和絲氨酸減少[27-30]。Kimberly等[27]通過靶向分析證實超急性中風患者血漿中纈氨酸以及其他支鏈氨基酸(亮氨酸和異亮氨酸)水平降低，且支鏈氨基酸血漿水平降低的幅度與卒中患者的梗死面積和臨床殘疾相關。另外，一項前瞻性研究表明，基線支鏈氨基酸增加會增加心血管疾病尤其是缺血性卒中的風險[31]。為了區分缺血性和出血性中風，Hu等[32]鑒定了缺血性(n=129)和出血性(n=73)中風的差異代謝物(如天冬酰胺、瓜氨酸、亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸和纈氨酸)。

有學者對中國30歲至79歲中風患者(1 146例IS患者，1 138例ICH患者)進行巢式病例對照研究，探討血漿代謝指標與發生缺血性中風和腦出血風險之間的關系，結果表明膽固醇與IS負相關，甘油三酯與IS正相關，但是與ICH無關[33]。已有研究采用脂質組學和代謝組學方法對脂質代謝物與缺血性卒中之間的關聯進行評估。這些研究結果表明，脂質分子可能在缺血性卒中的病因學中扮演著雙重角色，即有些脂類增加會導致中風風險增加，而有些脂類水平提高使中風風險降低。具體而言，神經酰胺、二?；视汀⒍既┧帷⒘u基二十碳四烯酸、羥基十八碳二烯酸、溶血磷脂酰膽堿(LPC)和三?；视退坪踉黾恿巳毖灾酗L的風險[26,29,34-35]。在缺血性中風患者中，不飽和脂肪酸側鏈脂質、膽固醇、亞油酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸、游離脂肪酸、葡糖神經酰胺、磷脂酰乙醇胺、植物鞘氨醇、二氫鞘氨醇和LPC含量減少[29,35-37]；LPC(16∶0)水平降低或者LPC(20∶4和20∶5)水平提高都會增加罹患缺血性卒中的風險[29,35,37]；而血漿LPC(16∶0和20∶4)聯合其他指標(血壓、臨床特征、癥狀持續時間等)可用于預測卒中復發。代謝組學也被用于預測急性缺血性病變的神經影像學特征，共有211種代謝物與缺血性損傷體積相關，包括LPC(20∶4和22∶6)、次黃嘌呤/蘇氨酸、亮氨酸和其他3種未知化合物[38]。有研究[39]采用非靶向脂質組學方法來區分癥狀性和無癥狀的頸動脈粥樣硬化斑塊，結果顯示磷脂酰膽堿(16∶0/20∶4和16∶0/18∶1)、磷脂酰乙醇胺(18∶1/18∶0)、花生四烯酸和未鑒定的脂質代謝物在內的許多標志物能更好地預測中風風險。Mariona等[23]采用LC-MS對131例TIA患者的血漿樣本進行代謝組學分析，結果顯示LPC(16∶0)與中風復發顯著相關，而且LPC(20∶4)也可以作為中風復發的標志物，這組新的標志物對中風復發的預測能力比傳統的預測方法更準確。

2.2 缺血性中風病因分型標志物

雖然目前的診斷手段可以對大動脈粥樣硬化、小動脈腦卒中和心源性腦栓塞進行診斷，仍然有約30%的患者出院時病因未明[40]。尋找IS分型相關的生物標志物，了解未明病因患者的發病原因，實施針對性的治療和相應的二級預防措施，可以降低其中風復發率。在缺血性卒中病因分型標志物的檢測研究中，Nelson等[41]使用液相色譜-質譜聯用測定了367名急性卒中患者血漿樣本中的144種代謝物，將心源性和非心源性樣本進行比較，發現三羧酸代謝物琥珀酸、α-酮戊二酸和蘋果酸與心源性IS相關。此外，通過二分法預測琥珀酸鹽與卒中復發有關。Nielsen等[42]在小鼠永久性局灶性腦缺血2 h、24 h、5 d、7 d和20 d后，對小鼠腦切片進行質譜成像以了解腦部炎癥發生過程中特征化合物的時空變化，結果發現雙單酰甘油磷酸酯BMP(22∶6/22∶6)和N-酰基-磷脂酰乙醇胺可分別作為吞噬巨噬細胞/小膠質細胞和死亡神經元的潛在生物標志物。許多其他化合物被發現與缺血性中風亞型息息相關，比如二十二碳六烯酸(DHA)、15-脫氧-△12，14-前列腺素J2(15-d-PGJ2)、神經酰胺和氧化型磷脂與低風險動脈粥樣硬化中風有關，二十二碳五烯酸(DPA)可以降低心源性IS的風險[43-44]，同型半胱氨酸等與腔隙性中風相關[45-48],但對于IS病因亞型標志物的研究仍然很有限。

3 總結與展望

基于質譜的各種方法已被應用于尋找缺血性中風標志物，并已發現了一些蛋白質和小分子標志物，主要有S100B、GFAP、UCH-L1、NSE、氨基酸、脂質[25,49-50]。這些標志物表達變化有可能可以用于診斷中風以及缺血性中風病因分型，但在樣本收集、研究結果一致性方面尚需更多驗證，而且在臨床應用方面需要作進一步探究。此外，亦有研究指出單一標志物因其特異性和靈敏度的不足，在實際臨床應用方面仍有局限性，而以一組標志物進行標志在臨床上會更有效[51]，組學研究亦需要有更統一、標準的標志物篩選以及統計分析方法。在樣本類型方面，有研究表明[52]外泌體是疾病階段特異性信息的重要來源，而且可以透過血腦屏障，是中風標志物發現的有利樣本來源。另外，隨著質譜新技術的發展，直接分析質譜技術，如實時直接分析(Directanalysis in real time,DART)和解吸電噴霧電離(Desorption electrospray ionization,DESI)技術[53-54]，可以快速分析樣本，在提高分析靈敏度和準確率的同時，縮短中風診斷時間，因此開發基于直接質譜的診斷方法顯得尤為重要。